Een praktische kennis van confocale fluorescentiemicroscopie
Het basisprincipe van confocale fluorescentiemicroscopie: gebruik een puntlichtbron om het preparaat te verlichten om een kleine, goed gedefinieerde lichtvlek op het brandpuntsvlak te vormen. De fluorescentie die door de vlek wordt uitgezonden nadat deze is verlicht, wordt opgevangen door de objectieflens en teruggestuurd naar de dichroïsche spiegel langs het oorspronkelijke verlichtingslichtpad. vormen een straalsplitser. De spectrometer stuurt de fluorescentie rechtstreeks naar de detector. Er bevindt zich een gaatje voor de lichtbron en de detector, die respectievelijk het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje worden genoemd. De geometrische afmetingen van de twee zijn consistent, ongeveer 100-200nm; ten opzichte van het lichtpunt op het brandpuntsvlak zijn de twee geconjugeerd, dat wil zeggen dat het lichtpunt door een reeks lenzen gaat en uiteindelijk tegelijkertijd kan worden scherpgesteld op het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje. Op deze manier kan het licht van het brandpuntsvlak worden geconcentreerd binnen het bereik van het detectiegat, terwijl het verstrooide licht van boven of onder het brandvlak buiten het detectiegat wordt geblokkeerd en niet kan worden afgebeeld. Het monster wordt punt voor punt gescand met de laser, en de fotovermenigvuldigingsbuis achter het detectiegaatje verkrijgt ook punt voor punt het confocale beeld van het overeenkomstige licht, dat wordt omgezet in een digitaal signaal en naar de computer wordt verzonden, en uiteindelijk wordt geaggregeerd op het scherm in een helder confocaal beeld van het gehele brandpuntsvlak. .
Elk brandvlakbeeld is feitelijk een optische dwarsdoorsnede van het preparaat. Deze optische doorsnede heeft altijd een bepaalde dikte en wordt ook wel een optische dunne doorsnede genoemd. Omdat de lichtintensiteit bij het brandpunt veel groter is dan de lichtintensiteit bij het niet-brandpunt, en het niet-brandpuntsvlaklicht wordt gefilterd door het gaatje, is de velddiepte van het confocale systeem ongeveer nul. Scannen langs de Z-asrichting kan optische tomografie realiseren, waardoor het gewenste wordt gevormd. Observeer de tweedimensionale optische sectie op de gefocusseerde plek van het monster. Door het scannen van het XY-vlak (brandpuntsvlak) te combineren met scannen op de Z-as (optische as), door continue niveaus van tweedimensionale beelden te accumuleren en deze te verwerken met gespecialiseerde computersoftware, kan een driedimensionaal beeld van het monster worden verkregen.
Dat wil zeggen dat het detectiegaatje en het gaatje van de lichtbron altijd op hetzelfde punt zijn gefocusseerd, zodat de fluorescentie die buiten het focusvlak wordt geëxciteerd het detectiegaatje niet kan binnendringen.
De eenvoudige uitdrukking van het werkingsprincipe van laserconfocaal is dat het laser als lichtbron gebruikt. Op basis van traditionele fluorescentiemicroscoopbeeldvorming worden een laserscanapparaat en een conjugaatfocusapparaat toegevoegd, en het systeem wordt bestuurd door een computer om digitale beelden te verzamelen en te verwerken.
