Toepassing van Fluorescentie Totale interne reflectie Fluorescentiemicroscopie
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), fluorescentiemicroscoop met totale interne reflectie, wanneer licht een medium binnenkomt met een lagere brekingsindex van een medium met een hoge brekingsindex, als de invalshoek groot genoeg is, wordt al het licht gereflecteerd zonder breking, maar in De interface van de twee media produceert verdwijnende golven die de fluorescentie binnen 100 nm nabij de interface kunnen opwekken om de observatie van het objectoppervlak te realiseren. Het excitatielicht kan door de illuminator van een conventionele fluorescentiemicroscoop of een speciale illuminator worden gestuurd en de invalshoek van de laser kan worden geregeld. De instantane veldexcitatiemethode wordt gebruikt om te voorkomen dat het excitatielicht de detector binnendringt. Het excitatielicht op het grensvlak tussen glas en water produceert een volledig intern geïmplementeerd door reflectie. Vanwege de exponentiële verzwakking van het excitatielicht, zal alleen het monstergebied zeer dicht bij het totale reflectieoppervlak fluorescentiereflectie produceren, wat de interferentie van achtergrondlichtruis met het observatiedoel aanzienlijk vermindert, dus deze technologie wordt veel gebruikt in de dynamische observatie van celoppervlaktestoffen.
Schematisch diagram van fluorescentiemicroscopie met totale interne reflectie (TIRFM)
①Sample ②Evanescent wave range ③Cover glass ④Oil immersion ⑤Target ⑥Emission beam (signaal) ⑦Excitation beam
Om totale interne reflectie te bereiken is een grote invalshoek nodig, de invalshoek bij het grensvlak glas-water is bijvoorbeeld groter dan 61 graden. Dit kan worden bereikt door een prisma, prisma-gebaseerde TIRFM genoemd, of door een objectieflens met een hoge numerieke apertuur, die objectieftype TIRFM wordt genoemd. De huidige gecommercialiseerde fluorescentiemicroscopen met totale interne reflectie zijn over het algemeen van het type objectieflens, met hoge snelheid en hoge precisie.
Totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie wordt veel gebruikt in sommige biologische velden omdat het fluorescentiewaarneming kan realiseren in een zeer dun bereik (minder dan 100 nm) op het oppervlak van objecten. Zoals de volgende toepassingen:
Observatie van beelden van het celoppervlak: structuur van het celmembraanoppervlak, contact met het celoppervlak, dynamiek van het membraanoppervlak/eiwitlokalisatie.
Observatie en manipulatie van één molecuul: myosine, actine en Cy{1}}gelabeld ATP.
Beweging van het celmembraanoppervlak: zoals verzwelging van blaasjes, uitademing van blaasjes en exocriene blaasjes. de
Observatie van calciumvonkverschijnsel in celmembraan, monitoring van ionenkanalen.
Moleculair motorisch onderzoek: rotatiemotoren, cytoskeletale eiwitten, polymeren, G-eiwitten, ringeiwitten, nucleotidemotoren.
Naast de biologie heeft het ook goede toepassingen op het gebied van de chemie voor het waarnemen van chemische moleculaire structuren.
