Basisstructuur van confocale fluorescentiemicroscopie
(1) Scanmodule
De scanmodule bestaat voornamelijk uit een gaatjeslichtbalk (die de dikte van optische plakjes regelt), een spectroscoop (de richting van de lichtvoortplanting verandert afhankelijk van de golflengte), een emissiefluorescentiecolorimeter (die licht binnen een bepaald golflengtebereik selecteert voor detectie), en een detector (fotomultiplicatorbuis). De gemengde fluorescentie in het fluorescerende monster komt de scanner binnen en nadat deze is geselecteerd door de detectie-pinhole-lichtbalk, spectrometer en colorimeter, wordt deze verdeeld in verschillende monochromatische fluorescentie, die in verschillende fluorescentiekanalen worden gedetecteerd en overeenkomstige confocale beelden vormen. Tegelijkertijd kunnen verschillende parallelle monochromatische fluorescentiebeelden en hun samengestelde beelden op het computerscherm worden weergegeven.
(2) Fluorescentiemicroscopiesysteem
Microscoop is het belangrijkste onderdeel van LSCM, dat verband houdt met de beeldkwaliteit van het systeem. Het optische pad van de microscoop kan eenvoudig worden ingevoegd in een op oneindig ver verwijderd optisch systeem met optische opties, zonder dat dit de beeldkwaliteit en meetnauwkeurigheid beïnvloedt. Het objectief moet een apochromatisch objectief met een grote numerieke apertuur en vlak veld zijn, wat gunstig is voor fluorescentie-acquisitie en heldere beeldvorming. De conversie van de objectieflensgroep, de selectie van de kleurfiltergroep, de bewegingsaanpassing van het podium en de geheugenvergrendeling van het brandpuntsvlak moeten allemaal automatisch door de computer worden geregeld.
De fluorescentiemicroscoop die wordt gebruikt bij confocale laserscanningmicroscopie is over het algemeen hetzelfde als een conventionele fluorescentiemicroscoop, maar heeft zijn eigen kenmerken: hij moet worden aangesloten op een scanner, zodat de laser het microscoopobjectief kan binnendringen om het monster te bestralen en te maken de door het monster uitgezonden fluorescentie bereikt de detector; Er is een apparaat voor lichtpadconversie nodig, dat kwiklampen omzet in lasers, en de lichtintensiteit van de kwiklamp kan worden aangepast.
(3) Gemeenschappelijke lasers
De laserbronnen die worden gebruikt bij confocale microscopie voor laserscannen omvatten enkele laser- en multi-lasersystemen, en de algemeen gebruikte lasers omvatten de volgende drie typen:
Halfgeleiderlaser: 405 nm (nabij ultraviolette spectraallijn)
Argon-ionenlaser: 457 nm, 477 nm, 488 nm, 514 nm (blauwgroen licht)
He-Ne-laser: 543 nm (groen licht He-Ne groene laser) 633 nm (rood licht He-Ne rode laser)
UV-laser (UV-laser): 351 nm, 364 nm (UV-licht)
(4) Hulpapparatuur
Luchtgekoelde, watergekoelde koelsystemen en geregelde voedingen.
Het basiswerkprincipe van een confocale laserscanmicroscoop is om eerst een bepaalde golflengte van excitatielicht uit de laser uit te zenden. Na versterking gaat het licht door de verlichte pinhole-lichtbalk in de scanner en vormt een puntlichtbron. De objectieflens focust op het brandpuntsvlak van het monster en de overeenkomstige verlichte punten op het monster worden aangeslagen en zenden fluorescentie uit. Nadat het door de lichtbalk van het detectiegat is gegaan, bereikt het de detector en wordt afgebeeld op het computerbewakingsscherm. Op deze manier wordt een compleet confocaal beeld gevormd door de fluorescentiebeelden van elk punt van het monster op het brandvlak, dat een lichtplak wordt genoemd.
