Classificatie en werking van microscopen voor celonderzoek
De microscoop is het primaire instrument voor het observeren van cellen. Volgens verschillende lichtbronnen kan het worden onderverdeeld in twee categorieën: optische microscopen en elektronenmicroscopen. De eerste gebruikt zichtbaar licht (UV-microscopen gebruiken ultraviolet licht) als lichtbron, terwijl de laatste elektronenstralen als lichtbron gebruikt.
-,Optische microscoop
(1) Gewone optische microscoop
Gewone biologische microscopen zijn samengesteld uit drie delen, namelijk: ① verlichtingssysteem, inclusief lichtbron en condensor; ② optisch vergrotingssysteem, bestaande uit objectieflens en oculair, het hoofdgedeelte van de microscoop. Om sferische aberratie en chromatische aberratie te elimineren, worden zowel het oculair als het ③mechanische objectief gebruikt om het materiaal te fixeren en observatie te vergemakkelijken (Afbeelding 2-1).
Of het beeld van de microscoop helder is, wordt niet alleen bepaald door de vergroting, maar ook door de resolutie van de microscoop. De resolutie verwijst naar het vermogen van de microscoop (of het menselijk oog om 25 cm verwijderd te zijn van het doel) om de kleinste afstand tussen objecten te onderscheiden. De grootte van de resolutie wordt bepaald door De golflengte en diafragmaverhouding van licht en de brekingsindex van het medium worden uitgedrukt door de formule:
In de formule: n=brekingsindex van medium;=openingshoek (de openingshoek van het preparaat ten opzichte van de objectieflensopening), NA=lensopening (numerieke opening). De lenshoek is altijd kleiner dan 180 graden, dus de maximale waarde van sina/2 moet kleiner zijn dan 1.
De brekingsindex van het glas dat wordt gebruikt om de optische lens te maken, is 1,65 tot 1,78, en de brekingsindex van het gebruikte medium ligt dichter bij het glas, hoe beter. Voor droge objectieflenzen is het medium lucht en is de diafragmaverhouding van de lens over het algemeen 0.05 tot 0,95; voor olielenzen wordt cederolie als medium gebruikt en de diafragmaverhouding van de lens kan bijna 1,5 zijn.
De golflengte van gewoon licht is {{0}}nm, dus de resolutiewaarde van de microscoop zal niet minder zijn dan 0.2μm, en de resolutie van het menselijk oog is 0.2mm, dus de maximale vergroting van het algemene microscoopontwerp is meestal 1000X.
(2) Fluorescentiemicroscopie
Sommige stoffen in cellen, zoals chlorofyl, kunnen fluoresceren nadat ze zijn bestraald met ultraviolette stralen; sommige stoffen zelf kunnen niet fluoresceren, maar als ze worden gekleurd met fluorescerende kleurstoffen of fluorescerende antilichamen, kunnen ze ook fluoresceren als ze worden bestraald met ultraviolette stralen, en de fluorescentiemicroscoop (Fig. 2-2, 3, 4) is een van de hulpmiddelen voor kwalitatief en kwantitatief onderzoek naar dergelijke stoffen.
Fluorescentiemicroscopen en gewone microscopen hebben de volgende verschillen:
1. De verlichtingsmethode is meestal epi-verlichting, dat wil zeggen dat de lichtbron op het monster wordt geprojecteerd door de objectieflens (Figuur 2-3);
2. De lichtbron is ultraviolet licht, de golflengte is korter en de resolutie is hoger dan die van gewone microscopen;
3. Er zijn twee speciale filters: het filter voor de lichtbron wordt gebruikt om zichtbaar licht uit te filteren en het filter tussen het oculair en de objectieflens wordt gebruikt om ultraviolet licht uit te filteren om de ogen te beschermen.
(3) Confocale microscoop met laserscanning
Confocale laserscanningmicroscoop (confocale laserscanningmicroscoop, figuur 2-5, 6) gebruikt laser als scanlichtbron en scant beeldvorming punt voor punt, lijn voor lijn, oppervlak voor oppervlak, en de scanlaser en fluorescentieverzameling delen een objectieflens, en de focus van de objectieflens is Het brandpunt van de scanlaser is ook het objectpunt van onmiddellijke beeldvorming. Omdat de golflengte van de laserstraal kort is en de straal erg dun is, heeft de confocale laserscanningmicroscoop een hogere resolutie, die ongeveer 3 keer zo groot is als die van een gewone optische microscoop. Het systeem wordt één keer scherpgesteld en de scan is beperkt tot één vlak van het monster. Wanneer de scherpsteldiepte verschillend is, kunnen beelden van verschillende diepteniveaus van het monster worden verkregen. Deze beeldinformatie wordt opgeslagen in de computer. Door middel van computeranalyse en simulatie kan de driedimensionale structuur van het celmonster worden weergegeven.
Confocale laserscanningmicroscopie kan niet alleen worden gebruikt om celmorfologie te observeren, maar ook voor kwantitatieve analyse van intracellulaire biochemische componenten, optische dichtheidsstatistieken en meting van celmorfologie.
(4) Donkerveldmicroscoop
De donkerveldmicroscoop (donkerveldmicroscoop, figuur 2-7) heeft een lichtblad in het midden van de condensor, zodat het verlichtingslicht niet direct de menselijke lens binnendringt, en alleen het licht dat door het monster wordt gereflecteerd en gebroken mag de objectieflens binnendringen, dus de achtergrond van het gezichtsveld is zwart, de randen van objecten zijn helder. Met deze microscoop kunnen deeltjes zo klein als 4-200nm worden gezien en de resolutie kan 50 keer hoger zijn dan die van gewone microscopen.
(5) Fasecontrastmicroscoop
Fasecontrastmicroscoop (fasecontrastmicroscoop, figuur 2-8, 9) door P. Zernike werd uitgevonden in 1932 en won er in 1953 de Nobelprijs voor natuurkunde voor. Het grootste kenmerk van deze microscoop is dat hij ongekleurde exemplaren en levende cellen kan waarnemen.
Het basisprincipe van fasecontrastmicroscopie is het veranderen van het optische padverschil van het zichtbare licht dat door het preparaat gaat in een amplitudeverschil, waardoor het contrast tussen verschillende structuren wordt verbeterd en verschillende structuren duidelijk zichtbaar worden. Nadat het licht door het preparaat is gegaan, wordt het gebroken, afgeweken van het oorspronkelijke optische pad en vertraagd met 1/4λ (golflengte). Versterk, verhoog of verlaag de amplitude, verhoog het contrast. Fasecontrastmicroscopen hebben qua structuur twee bijzondere kenmerken die verschillen van gewone optische microscopen:
1. Het ringvormige diafragma bevindt zich tussen de lichtbron en de condensor, en zijn functie is om het licht dat door de condensor gaat een holle lichtkegel te laten vormen en op het preparaat te concentreren.
2. De faseplaat (ringvormige faseplaat) voegt een met magnesiumfluoride gecoate faseplaat toe aan de objectieflens, die de fase van direct licht of afgebogen licht met 1/4λ kan vertragen. Er zijn twee soorten:
①Een plus-faseplaat: het directe licht wordt vertraagd met 1/4λ. Nadat de twee groepen lichtgolven zijn gecombineerd, worden de lichtgolven bij elkaar opgeteld en wordt de amplitude vergroot. De structuur van het preparaat is helderder dan het omringende medium en vormt een helder contrast (of negatief contrast).
② B plus faseplaat: het afgebogen licht wordt vertraagd met 1/4λ. Nadat de twee sets stralen zijn gecombineerd, worden de lichtgolven afgetrokken en wordt de amplitude kleiner, waardoor een donker contrast (of positief contrast) wordt gevormd en de structuur donkerder is dan het omringende medium.
