Vergelijking tussen confocale microscoop en gewone optische microscoop
Algemene optische microscoop
De algemene biologische microscoop bestaat uit drie delen, namelijk: ① verlichtingssysteem, inclusief lichtbron en condensor; ② Optisch versterkingssysteem, dat bestaat uit een objectieflens en een oculair, is het hoofdgedeelte van de microscoop. Om sferische aberratie en chromatische aberratie te elimineren, zijn zowel het oculair als de objectieflens samengesteld uit complexe lensgroepen; (3) mechanisch apparaat, gebruikt voor het bevestigen van materialen en gemakkelijke observatie.
Of het microscoopbeeld helder is of niet, hangt niet alleen af van de vergroting, maar ook van de resolutie van de microscoop. Resolutie verwijst naar het vermogen van de microscoop (of de plaats waar menselijke ogen zich op 25 cm afstand van het doel bevinden) om het kleine interval van het object zui te onderscheiden. De resolutie hangt af van de golflengte van het licht, de diafragmaverhouding en de brekingsindex van het medium, wat wordt uitgedrukt door de formule:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎzonde /2
Waar: n= brekingsindex van medium;=spiegelhoek (de openingshoek van het monster ten opzichte van de lensopening) en NA= numerieke opening. De spiegelhoek is altijd kleiner dan 180? Daarom moet de zui-waarde van sina/2 kleiner zijn dan 1.
De brekingsindex van het glas dat wordt gebruikt voor het maken van optische lenzen is 1,65 ~ 1,78, en de brekingsindex van het gebruikte medium ligt dichter bij die van het glas, hoe beter. Voor de droge objectieflens is het medium lucht en is de diafragmaverhouding doorgaans 0.05 ~ 0,95; De olielens gebruikt geurig asfalt als medium en de openingssnelheid van de lens kan bijna 1,5 zijn.
De golflengte van gewoon licht is 400~700 nm, dus de resolutie van de microscoop is niet minder dan 0,2 μm, en de resolutie van het menselijk oog is 0,2 mm, dus de grote vergroting van zui, ontworpen door algemene microscoop is meestal 1000X x.
Waarom heb je een confocale microscoop nodig?
1. De optische microscoop is geperfectioneerd dankzij de inspanningen en verbeteringen van onze grote voorgangers. In feite kunnen gewone microscopen ons eenvoudig en snel prachtige microscopische beelden opleveren. Er vond echter een gebeurtenis plaats die revolutionaire innovatie in deze bijna perfecte microscoopwereld bracht, namelijk de uitvinding van de "laserscanning confocale microscoop". Deze nieuwe microscoop wordt gekenmerkt door het gebruik van een optisch systeem dat alleen de beeldinformatie extraheert op het vlak waar de focus is geconcentreerd, en de verkregen informatie herstelt in het beeldgeheugen terwijl de focus wordt gewijzigd, zodat een levendig beeld met volledige driedimensionale informatie ontstaat. kan worden verkregen. Door deze methode kan op eenvoudige wijze informatie over de vorm van het oppervlak worden verkregen die niet door gewone microscopen kan worden bevestigd. Bovendien zijn voor gewone optische microscopen "het verbeteren van de resolutie" en "het verdiepen van de focusdiepte" tegenstrijdige omstandigheden, vooral bij hoge vergroting, maar voor confocale microscopen is dit probleem opgelost.
2. Voordelen van confocaal optisch systeem
Een confocaal optisch systeem verlicht het monsterpunt en het gereflecteerde licht wordt ook ontvangen door puntreceptoren. Wanneer het monster in de focuspositie wordt geplaatst, kan bijna al het gereflecteerde licht de fotoreceptor bereiken, maar wanneer het monster afwijkt van de focus, kan het gereflecteerde licht de fotoreceptor niet bereiken. Dat wil zeggen dat in het confocale optische systeem alleen het beeld dat samenvalt met de focus zal worden weergegeven, en dat de facula en het nutteloze verstrooide licht zullen worden afgeschermd.
3. Waarom een laser gebruiken?
In het confocale optische systeem wordt het monster verlicht en wordt het gereflecteerde licht ook ontvangen door een puntfotoreceptor. Daarom is een puntlichtbron noodzakelijk. Laser behoort tot een zeer puntige lichtbron. In de meeste gevallen gebruikt de lichtbron van de confocale microscoop een laserlichtbron. Bovendien zijn de kenmerken van laser, zoals monochromaticiteit, directiviteit en uitstekende straalvorm, ook belangrijke redenen voor het brede gebruik ervan.
4. Real-time observatie op basis van snelle scanning wordt mogelijk.
Bij het laserscannen wordt de Acoustic Optical Deflector (AO prime element) in horizontale richting gebruikt en de Servo Galvano-spiegel in verticale richting. Omdat er geen mechanisch trillingsdeel in de akoestisch-optische afbuigeenheid zit, kan deze op hoge snelheid scannen en is het mogelijk om in realtime te observeren op het monitoringscherm. De hoge snelheid van deze camera is een zeer belangrijk project dat rechtstreeks van invloed is op de snelheid van scherpstellen en het ophalen van positie.
5. Relatie tussen focuspositie en helderheid
In het confocale optische systeem is de helderheid groot wanneer het monster correct in de focuspositie is geplaatst, en ervoor en erna zal de helderheid scherp afnemen (ononderbroken lijn in figuur 4). Deze gevoelige selectiviteit van het brandpuntsvlak is ook het principe van het meten van de hoogterichting van de confocale microscoop en het vergroten van de brandpuntsdiepte. Daarentegen heeft de gewone optische microscoop geen duidelijke helderheidsverandering voor en na de focuspositie (stippellijn in figuur 4).
6. Hoog contrast en hoge resolutie
Bij een algemene optische microscoop zal het gereflecteerde licht dat afwijkt van de focus interfereren en overlappen met het focusbeeldvormingsgedeelte, waardoor het beeldcontrast wordt verminderd. In het confocale optische systeem daarentegen worden het verstrooide licht buiten het brandpunt en het verstrooide licht binnen de objectieflens bijna volledig verwijderd, zodat een beeld met een zeer hoog contrast kan worden verkregen. Omdat het licht tweemaal door de objectieflens gaat, wordt bovendien het puntbeeld eerst verscherpt en wordt ook de resolutie van de microscoop verbeterd.
7. Optische lokalisatiefunctie
In het confocale optische systeem wordt het gereflecteerde licht van het andere deel dan het brandpunt afgeschermd door microporiën. Daarom wordt bij het observeren van een driedimensionaal monster een beeld gevormd dat lijkt op het beeld dat wordt gevormd nadat het monster met de focus is gesneden (Figuur 5). Dit effect wordt optische lokalisatie genoemd en behoort tot een van de specialiteiten van confocale optische systemen.
8. Focus bewegende geheugenfunctie
Het zogenaamde gereflecteerde licht buiten het brandpunt wordt afgeschermd door de microporiën. Aan de andere kant kan worden aangenomen dat alle punten op het beeld gevormd door het confocale optische systeem samenvallen met de focus. Daarom, als het driedimensionale monster langs de Z-as (optische as) richting wordt verplaatst, zal het beeld worden verzameld en in het geheugen worden opgeslagen, en zui zal uiteindelijk het beeld krijgen dat wordt gevormd door het samenvallen van het hele monster en de focus . Op deze manier wordt de functie van oneindige scherptediepte de mobiele geheugenfunctie genoemd.
9. Meetfunctie voor oppervlaktevorm
Bij de focusverplaatsingsfunctie kan de oppervlaktevorm van het monster contactloos worden gemeten door een hoogteregistratielus toe te voegen. Op basis van deze functie is het mogelijk om de Z-ascoördinaten vast te leggen die worden gevormd door de grote helderheidswaarde van zui in elke pixel, en op basis van deze informatie kan de informatie met betrekking tot de oppervlaktevorm van het monster worden verkregen.
10. Zeer nauwkeurige micromaatmeetfunctie
De lichtontvangsteenheid maakt gebruik van een eendimensionale CCD-beeldsensor, zodat deze niet wordt beïnvloed door de scankanteling van het scanapparaat, zodat metingen met hoge precisie kunnen worden uitgevoerd. Bovendien kan, omdat de focusverplaatsingsgeheugenfunctie met instelbare focusdiepte tegelijkertijd wordt toegepast, de meetfout veroorzaakt door focusoffset worden geëlimineerd.
11. Driedimensionale beeldanalyse
Met behulp van de meetfunctie voor de oppervlaktevorm kan eenvoudig een driedimensionaal beeld van het monsteroppervlak worden gemaakt. Niet alleen dat, maar er kunnen ook vele soorten analyses worden uitgevoerd, zoals: oppervlakteruwheidsmeting, oppervlakte, volume, oppervlakte, rondheid, straal, lengte van zui, omtrek, zwaartepunt, tomografisch beeld, FFT-transformatie, lijn breedtemeting enzovoort.
Laser confocale scanningmicroscoop kan niet alleen worden gebruikt om de celmorfologie te observeren, maar ook voor kwantitatieve analyse van biochemische componenten in cellen, optische dichtheidsstatistieken en celmorfologiemeting.
