Ontwikkelingstrend van confocale microscopie
Om betere observatieresultaten op technisch niveau te verkrijgen, richt confocale microscopie zich op het verbeteren van het technische niveau vanuit de aspecten van het verbeteren van de resolutie, het verminderen van fototoxiciteit, het verhogen van de scansnelheid, het observeren van dikke monsters en het observeren in vivo. Momenteel is het Z-effectief. Wat Zda voor confocale microscopietechnologie promoot, is microscopie met ultrahoge resolutie, die de optische limiet doorbreekt en onderzoekers in staat stelt fijnere celstructuren te verkrijgen, wat bevorderlijk is voor een dieper begrip van levensactiviteiten door onderzoekers. De volgende onderzoeksfocus van confocale microscopietechnologie zou zich moeten concentreren op de volgende punten:
1. Hogere scansnelheid
Momenteel wordt de confocale scansnelheid beperkt door de mechanische structuur van de scanapparatuur en kan de resolutie alleen worden opgeofferd om een hogere scansnelheid te verkrijgen. Veel biologische processen gaan zo snel dat ze ondetecteerbaar blijven.
2. Meer perfecte technologie met ultrahoge resolutie
Momenteel omvatten technologieën met ultrahoge resolutie STORM, PALM, STED en SSIM, met resoluties variërend van 20 tot 200 nm, maar elke technologie heeft bepaalde gebreken, zoals monsterverwerking, richting van de Z-as, fototoxiciteit, enz. Het is lang niet perfect, en het is vaak moeilijk om de limietresolutie te bereiken bij daadwerkelijke waarneming.
3. Sterkere compatibiliteit
Confocale microscopietechnologie omvat een verscheidenheid aan excitatiemethoden, zoals de hierboven genoemde multiphoton- en lichtbladobservatie, en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing kan theoretisch een reeks lasersystemen delen. Superresolutiemicroscopie kan worden gecombineerd met witte lasertechnologie. Door de patentkwesties van verschillende bedrijven is er echter nog ruimte voor verbetering op het gebied van volledigheid en compatibiliteit, en de huidige apparatuur kan de technische voordelen van de applicatie niet ten volle benutten.
Principes van confocale microscopie
Confocale microscoop bestaat uit vier delen: optisch microscoopsysteem, laserlichtbron, scanner en detectie- en verwerkingssysteem. Het gebruikt laser met goede coherentie als lichtbron. Het maakt gebruik van een geconjugeerd focusprincipe en apparaat op basis van een traditionele optische microscoop, en gebruikt een computer Een set van observatie-, analyse- en uitvoersystemen voor beeldverwerking.
De laserscanstraal gaat door het gaatje van het rooster om een puntlichtbron te vormen, die door de straalsplitser naar de objectieflens wordt gereflecteerd, op het preparaat wordt gefocust en wordt gescand. Nadat het monster is geëxciteerd, keert de uitgezonden fluorescentie terug naar de spectroscoop en verzamelt het naar de detectie-pinhole, en vervolgens wordt het omgezet in een elektrisch signaal door de fotovermenigvuldigerbuis en verzonden naar de computer om een duidelijk brandpuntsvlakbeeld weer te geven. Het excitatielicht wordt door het gaatje van het rooster op het monster gefocust en de fluorescentie wordt door de objectieflens op het gaatje gefocust. Dit proces vormt twee focusseringen, daarom wordt het een confocale microscoop genoemd.
Gewone biologische monsters hebben een complexe structuur en een bepaalde dikte. Wanneer waargenomen met een gewone fluorescentiemicroscoop, overlapt de door het monster uitgezonden fluorescentie elkaar en wordt de beeldresolutie sterk verminderd.
De confocale beeldvorming van de confocale microscoop kan het strooilicht en niet-meetlicht buiten het brandpuntsvlak effectief onderdrukken om de detector binnen te gaan, beeldvorming met een enkel brandpuntsvlak realiseren en de resolutie aanzienlijk verbeteren. Wanneer het podium gelijkmatig in horizontale richting beweegt, kan het een duidelijk enkellaags beeld vormen en in verticale richting kan het het laag-voor-laag scannen van het monster op verschillende diepten realiseren en de driedimensionale structuur verkrijgen van het monster na driedimensionale reconstructie, de zogenaamde "optische CT". Het monster wordt gelabeld met een fluorescerende sonde en vervolgens geobserveerd met een confocale microscoop. Niet alleen kunnen verschillende gefixeerde cellen en weefselstructuren worden waargenomen, maar ook de morfologie, structuur en ionen van levende cellen kunnen kwalitatief en kwantitatief worden waargenomen en regelmatig worden gemeten.
