Verschil tussen fluorescentiemicroscoop en normale microscoop
1. Kijk naar de verlichtingsmethode
De verlichtingsmethode van een fluorescentiemicroscoop is over het algemeen van het epitype, dat wil zeggen dat de lichtbron via de objectieflens op het testmonster wordt geplaatst.
2. Kijk naar de resolutie
Fluorescentiemicroscopen gebruiken ultraviolet licht als lichtbron, met een relatief korte golflengte, maar de resolutie is hoger dan die van gewone optische microscopen.
3, het verschil in het filter
Fluorescentiemicroscoop maakt gebruik van twee speciale filters, die voor de lichtbron worden gebruikt om zichtbaar licht uit te filteren, en die tussen de objectieflens en het oculair worden gebruikt om ultraviolet licht uit te filteren, wat de menselijke ogen kan beschermen.
Fluorescentiemicroscoop is ook een soort optische microscoop, voornamelijk omdat de golflengte die wordt opgewekt door de fluorescentiemicroscoop kort is, dus dit leidt tot het verschil in de structuur en het gebruik van de fluorescentiemicroscoop en de gewone microscoop. De meeste fluorescentiemicroscopen hebben een goede functie om zwak licht op te vangen. , dus onder extreem zwakke fluorescentie is het beeldvormingsvermogen ook goed. In combinatie met de voortdurende verbetering van fluorescentiemicroscopie in de afgelopen jaren, is ook de ruis sterk verminderd. Daarom worden steeds meer fluorescentiemicroscopen gebruikt.
Kennis van twee-foton fluorescentiemicroscopie
Het basisprincipe van excitatie met twee fotonen is: bij een hoge fotonendichtheid kunnen fluorescerende moleculen twee fotonen met een lange golflengte tegelijkertijd absorberen en na een zeer korte levensduur van de zogenaamde aangeslagen toestand een foton met een korte golflengte uitzenden ; het effect is hetzelfde als het gebruik van een foton met een golflengte die de helft van de lange golflengte is om een fluorescerend molecuul te exciteren. Excitatie met twee fotonen vereist een hoge fotonendichtheid, en om cellen niet te beschadigen, gebruikt twee-fotonenmicroscopie hoogenergetische modusvergrendelde gepulseerde lasers. Deze laser zendt laserlicht uit met een hoge piekenergie en een lage gemiddelde energie, met een pulsbreedte van slechts 100 femtoseconden en een frequentie van 80 tot 100 MHz. Wanneer een objectieflens met een hoge numerieke apertuur wordt gebruikt om de fotonen van de gepulseerde laser te focussen, is de fotonendichtheid in het brandpunt van de objectieflens het hoogst en vindt de excitatie met twee fotonen alleen plaats in het brandpunt van de objectieflens, dus de microscoop met twee fotonen heeft geen confocaal gaatje nodig, wat de efficiëntie van de fluorescentiedetectie verbetert.
In het algemene fluorescentieverschijnsel kan een fluorescerend molecuul vanwege de lage fotondichtheid van het excitatielicht slechts één foton tegelijkertijd absorberen en vervolgens een fluorescerend foton uitzenden door de stralingsovergang, die fluorescentie met één foton wordt genoemd. Voor het fluorescentie-excitatieproces met laser als lichtbron kan twee-foton of zelfs multi-foton fluorescentie optreden. Op dit moment is de intensiteit van de gebruikte excitatielichtbron hoog en voldoet de fotonendichtheid aan de eis dat het fluorescerende molecuul tegelijkertijd twee fotonen absorbeert. Bij het gebruik van een algemene laser als excitatielichtbron is de fotonendichtheid nog steeds niet voldoende om twee-fotonenabsorptie te produceren. Gewoonlijk wordt een femtoseconde gepulseerde laser gebruikt en het momentane vermogen kan de orde van megawatt bereiken. Daarom is de golflengte van de fluorescentie met twee fotonen korter dan de golflengte van het excitatielicht, wat equivalent is aan het effect dat wordt geproduceerd door de excitatie van de halve excitatiegolflengte.
Twee-foton fluorescentiemicroscopie heeft vele voordelen:
1) Licht met een lange golflengte wordt minder beïnvloed door verstrooiing dan licht met een korte golflengte en kan gemakkelijk het monster binnendringen;
2) De fluorescerende moleculen buiten het brandpuntsvlak worden niet aangeslagen, zodat meer excitatielicht het brandpuntsvlak kan bereiken, zodat het excitatielicht diepere monsters kan doordringen;
3) Langgolvig nabij-infrarood licht is minder giftig voor cellen dan licht met een korte golflengte;
4) Bij het bekijken van monsters met twee-fotonenmicroscopie zijn fotobleken en fototoxiciteit alleen aanwezig in het brandpuntsvlak. Daarom is twee-fotonenmicroscopie geschikter voor het bekijken van dikke exemplaren dan enkelfotonenmicroscopie, voor het bekijken van levende cellen of voor het uitvoeren van fotobleekexperimenten met een vast punt.
Kennis van confocale fluorescentiemicroscopie
Het basisprincipe van confocale fluorescentiemicroscopie: door een puntlichtbron te gebruiken om het preparaat te verlichten, wordt een kleine lichtvlek met een goed gedefinieerde omtrek gevormd op het brandpuntsvlak. gevormd door de bundelsplitser. De bundelsplitser stuurt de fluorescentie rechtstreeks naar de detector. Er is een gaatje voor de lichtbron en de detector, respectievelijk het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje genoemd. De geometrische afmetingen van de twee zijn hetzelfde, ongeveer 100-200 nm; ten opzichte van de lichtvlek op het brandpuntsvlak zijn de twee geconjugeerd, dat wil zeggen, de lichtvlek gaat door een reeks lenzen en kan uiteindelijk tegelijkertijd worden gefocust op het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje. Op deze manier kan het licht van het brandvlak worden geconcentreerd binnen het bereik van het detectiegat, terwijl het verstrooide licht van boven of onder het brandvlak buiten het detectiegat wordt geblokkeerd en niet kan worden afgebeeld. Het monster wordt punt voor punt gescand met de laser, en de fotovermenigvuldigerbuis verkrijgt na detectie van het gaatje ook punt voor punt het confocale beeld van het overeenkomstige licht, dat wordt omgezet in een digitaal signaal en wordt verzonden naar de computer, en uiteindelijk wordt geaggregeerd op het scherm in een duidelijk confocaal beeld van het gehele brandpuntsvlak. .
Elk brandpuntsvlakbeeld is eigenlijk een optische dwarsdoorsnede van het preparaat, en deze optische dwarsdoorsnede heeft altijd een bepaalde dikte, ook wel optische plak genoemd. Aangezien de lichtintensiteit bij het brandpunt veel groter is dan die bij het niet-brandpunt, en het niet-brandpuntsvlaklicht wordt uitgefilterd door het gaatje, is de scherptediepte van het confocale systeem ongeveer nul en scannen langs de Z-as kan optische tomografie realiseren, waardoor de Observe een tweedimensionale optische sectie vormt op de gefocuste plek van het monster. Door het scannen van het XY-vlak (brandvlak) te combineren met het scannen van de Z-as (optische as), door tweedimensionale beelden van opeenvolgende lagen te verzamelen en te verwerken met speciale computersoftware, kan een driedimensionaal beeld van het monster worden verkregen.
Dat wil zeggen, het detectie-speldengat en het lichtbron-speldengat zijn altijd op hetzelfde punt gefocusseerd, zodat de fluorescentie die buiten het focusseringsvlak wordt geëxciteerd, het detectie-speldengat niet kan binnendringen.
De eenvoudige uitdrukking van het werkingsprincipe van confocale laser is dat het een laser gebruikt als lichtbron, en op basis van traditionele fluorescentiemicroscoopbeeldvorming, een laserscanapparaat en een geconjugeerd focusseerapparaat zijn bevestigd, en de digitale beeldacquisitie en -verwerking systeem wordt aangestuurd door een computer.
