Verschillen en voor- en nadelen tussen transmissiefluorescentiemicroscopie en reflectiefluorescentiemicroscopie
1. Transmissiefluorescentiemicroscoop: De excitatielichtbron wordt via een condensor door het monstermateriaal gestuurd om de fluorescentie op te wekken. Algemeen gebruikte donkerveldconcentrators, of gewone concentrators, kunnen worden gebruikt om de reflector aan te passen om excitatielicht en zijlicht op het monster om te zetten. Dit is een relatief ouderwetse fluorescentiemicroscoop. Het voordeel is de sterke fluorescentie bij lage vergroting, terwijl het nadeel is dat de fluorescentie verzwakt bij toenemende vergroting. Daarom is het beter voor het observeren van grotere monstermaterialen.
2. Falling beam fluorescentiemicroscoop: Dit is een nieuw type fluorescentiemicroscoop dat zich in de moderne tijd heeft ontwikkeld. In tegenstelling tot de vorige valt het excitatielicht van de objectieflens naar beneden op het oppervlak van het monster, waarbij dezelfde objectieflens wordt gebruikt als de verlichtingscondensator en de objectieflens voor het verzamelen van fluorescentie. Er moet een dubbele kleurenbundelscheider aan het optische pad worden toegevoegd, dat een hoek van 45 graden vormt met het fotouranium. Het excitatielicht wordt gereflecteerd in de objectieflens en verzamelt zich op het monster. De door het monster gegenereerde fluorescentie en het door het oppervlak van de objectieflens en dekglas gereflecteerde excitatielicht komen gelijktijdig de objectieflens binnen en keren terug naar de tweekleurige bundelscheider, waardoor het excitatielicht en de fluorescentie worden gescheiden. Het resterende excitatielicht wordt vervolgens geabsorbeerd door het blokkeerfilter. Als er verschillende combinaties van excitatiefilters, tweekleurige straalscheiders en blokkeerfilters worden gebruikt, kunnen deze voldoen aan de behoeften van verschillende fluorescerende reactieproducten. De voordelen van deze fluorescentiemicroscoop zijn een uniforme gezichtsveldverlichting, heldere beeldvorming en sterkere fluorescentie bij hogere vergroting.
De voor- en nadelen van transmissiefluorescentiemicroscopie
Lichtbron: Hogedrukkwiklamp of halogeenlamp.
Spotlight-spiegel: gebruik van een donkerveldspot om excitatie en fluorescentie te scheiden.
Objectieflens: Elk type objectieflens kan worden gebruikt.
Monster: Dunne monsters zijn geschikter voor transmissieobservatie.
Voordelen: ① Door het gebruik van een donkerveldcondensor kan het excitatielicht de objectieflens niet binnendringen, waardoor het gemakkelijk wordt om een donkere achtergrond te vormen en een goed contrast te bereiken, en elke objectieflens kan voor observatie worden gebruikt. ② Bij gebruik van een objectief met lage vergroting is het helderder dan een reflecterende fluorescentiemicroscoop.
Nadeel: Het midden en de hoogte van de spot moeten correct worden afgesteld, anders kan er geen helder fluorescerend beeld worden verkregen. Vanwege de beperking van de brandpuntsafstand van de donkerveldspot kunnen dikke glasplaatjes niet worden gebruikt. Het verlichtingsgebied van het gezichtsveld mag niet te groot zijn, anders kan de fluorescentiekleur van het fluorescerende monster vervagen. Dikke of ondoorzichtige exemplaren zijn niet geschikt.
De voor- en nadelen van reflecterende fluorescentiemicroscopie
Lichtbron: Hogedrukkwiklamp of halogeenlamp.
Focusseringslens: Omdat de objectieflens als focusseringslens dient, is er geen noodzaak voor een focusseringslens.
Objectieflens: De gebruikte objectieflens moet in staat zijn voldoende ultraviolet licht door te laten en zelf geen fluorescentie te produceren, zonder beperking van de numerieke apertuur.
Specimen: Er kunnen zowel dikke als ondoorzichtige exemplaren worden waargenomen.
Voordelen: ① Omdat de objectieflens tevens als spotlight dient, vereist deze niet veel aanpassing. ② Door gebruik te maken van de Kolar-belichtingsmethode kunnen de effecten van diafragma- en gezichtsveldopeningen worden benut. Het numerieke diafragma van de objectieflens is niet beperkt en er kunnen ook beelden met een hoge resolutie worden verkregen bij een sterke vergroting. Dikke of ondoorzichtige exemplaren kunnen ook worden geobserveerd, en dikke dekglaasjes kunnen ook worden gebruikt. Andere observatiemethoden kunnen ook worden gecombineerd met gereflecteerde fluorescentie, vooral met de faseverschilmethode en de transmissiedifferentiële interferentiemethode. Het kan onnodig fenomeen van fluorescentiekleurvervaging voorkomen.
Nadeel: Bij gebruik van een grondvergrotingsobjectief is het beeld relatief donker, dus moet een objectief met een hoge numerieke opening worden gebruikt. Het filtersysteem moet excitatieluminescentie en fluorescentie effectief scheiden.
