Verschillen en kenmerken tussen fluorescentiemicroscoop en gewone optische microscoop
Fluorescentiemicroscoop verschilt van gewone optische microscoop. Het observeert het monster niet door de verlichting van een gewone lichtbron. In plaats daarvan gebruikt het licht van een bepaalde golflengte (meestal ultraviolet licht, blauwviolet licht) om het fluorescerende materiaal in het monster onder de microscoop te exciteren, waardoor het fluorescentie gaat uitzenden. Daarom dient de lichtbron van een fluorescentiemicroscoop niet als directe verlichting, maar als een energiebron die het interne fluorescerende materiaal van het monster exciteert. De reden waarom we het monster kunnen waarnemen is niet te wijten aan de verlichting van de lichtbron, maar aan het fluorescentiefenomeen dat wordt veroorzaakt doordat het fluorescerende materiaal in het monster de opgewonden lichtenergie absorbeert. Het is duidelijk dat het belangrijkste kenmerk van een fluorescentiemicroscoop is dat de lichtbron ervan een grote hoeveelheid excitatielicht in een specifiek golflengtebereik kan leveren, zodat de fluorescerende stoffen in het onderzochte monster de noodzakelijke intensiteit van excitatielicht kunnen verkrijgen. Tegelijkertijd moeten fluorescentiemicroscopen over overeenkomstige filtersystemen beschikken. Fluorescentiemicroscopie is een essentieel hulpmiddel voor geavanceerde fluorescentiehistochemie. Het is samengesteld uit een ultrahogedruklichtbron, een filtersysteem (inclusief excitatie- en onderdrukkingsfilterplaten), een optisch systeem en een fotografiesysteem. Het gebruikt licht van een bepaalde golflengte om het monster te prikkelen om fluorescentie uit te zenden.
1. Manieren om fluorescentie op te wekken: Afhankelijk van het golflengtebereik van licht, is het verdeeld in twee typen: UV-excitatiemethode (met behulp van ultraviolette verlichtingsmethode) en BV-excitatiemethode (met behulp van blauwviolet licht). De UV-excitatiemethode maakt gebruik van bijna-ultraviolet licht korter dan 400 nm voor excitatie. Bij deze methode is er geen zichtbaar excitatielicht, dus de waargenomen fluorescentie toont de inherente fluorescentie van de kleurstof, waardoor het gemakkelijk wordt om de specifieke fluorescentie op het monster te onderscheiden van de autofluorescentie van het achtergrondweefsel.
2. BV-excitatiemethode: excitatie van ultraviolet naar blauw licht gecentreerd op 404 nm en 434 nm. Deze methode maakt gebruik van blauw licht om het monster te verlichten, dus het afsnijfilter van het fluorescentieobservatiesysteem moet een filter gebruiken dat blauw licht volledig kan blokkeren en de vereiste groene en gele fluorescentie volledig kan doorlaten. Fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt bij methoden voor fluorescerende antilichamen. De maximale absorptiegolflengte van excitatielicht en de maximale emissiegolflengte van fluorescentie liggen relatief dichtbij, dus het filter dat wordt gebruikt in de BV-excitatiemethode moet een scherp afsnijfilter gebruiken. Bij deze methode kan blauw licht als excitatielicht worden gebruikt, zodat de absorptie-efficiëntie van fluorescerende pigmenten hoger is en er helderdere beelden kunnen worden verkregen. Het nadeel is dat fluorescentie onder 500 nm niet zichtbaar is, terwijl fluorescentie boven 500 nm ervoor zorgt dat het hele beeld geel lijkt. Bij de fluorescerende antilichaammethode wordt de specificiteit van de fluorescerende kleurstof meestal beoordeeld op basis van zijn unieke kleur. Daarom hebben de bovengenoemde tekortkomingen van de BV-excitatiemethode bij het bespreken van de subtiele specificiteit vaak een grote impact.
