Verbetering van de voordelen van laserscannende multifotonmicroscopie
Laserscanning multiphoton microscopie is een grote verbetering ten opzichte van optische microscopie. Het kan de diepe structuur van levende cellen, vaste cellen en weefsels observeren en kan heldere en scherpe meerlaagse Z-vlakstructuren verkrijgen, dat wil zeggen optische secties, waaruit het de driedimensionale vaste structuur van het monster kan construeren. Confocale microscopie maakt gebruik van een laserlichtbron die, na uitzetting, het gehele achterste brandpuntsvlak van de objectieflens vult en vervolgens door het lenssysteem van de objectieflens gaat om te convergeren naar een zeer klein punt op het brandpuntsvlak van het monster. Afhankelijk van de numerieke opening van de objectieflens is de diameter van het helderste verlichtingspunt ongeveer 0.25 ~ 0.8μm, en de diepte ongeveer 0.5 ~ 1.5μm . De grootte van de confocale vlek hangt af van het microscoopontwerp, de lasergolflengte, de kenmerken van de objectieflens, de statusinstellingen van de scaneenheid en de eigenschappen van het monster. Veldmicroscopie heeft een groot verlichtingsbereik en een grote diepte, terwijl confocale microscopie een gerichte verlichting heeft, gericht op een brandpunt op het brandpuntsvlak. Het meest fundamentele voordeel van confocale microscopie is dat het fijne optische secties kan uitvoeren van dikke fluorescerende monsters (die 50 μm of meer kunnen bereiken), en dat de dikte van de secties ongeveer 0,5 tot 1,5 μm is. Een reeks optische doorsnedebeelden kan worden verkregen door het preparaat op en neer te bewegen met behulp van de Z-as stappenmotor van de microscoop. De verwerving van beeldinformatie wordt binnen het vlak geregeld en zal niet worden verstoord door signalen die vanaf andere locaties op het preparaat worden uitgezonden. Na het verwijderen van de invloed van achtergrondfluorescentie en het verhogen van de signaal-ruisverhouding, zijn het contrast en de resolutie van confocale beelden aanzienlijk verbeterd in vergelijking met traditionele veldbelichte fluorescentiebeelden. In veel exemplaren zijn veel ingewikkelde structurele componenten met elkaar verweven om complexe systemen te vormen, maar zodra er voldoende optische secties kunnen worden verzameld, kunnen we ze via software in drie dimensies reconstrueren. Deze experimentele methode wordt veel gebruikt in biologisch onderzoek om de complexe structurele en functionele relaties tussen cellen of weefsels op te helderen.
