Hoeveel weet u over fluorescentiemicroscopie
Fluorescentiemicroscopen gebruiken over het algemeen kwiklampen met hoge intensiteit als excitatielichtbronnen. Filters worden gebruikt om ongewenst licht uit te filteren, waardoor alleen het zeer intense, pure licht overblijft dat de fluorofoor prikkelt. Nadat het monochromatische licht het monster door de objectieflens heeft bestraald, zal het monster worden geëxciteerd om licht uit te stralen (fluorescentie), en zowel de fluorescentie als het excitatielicht zullen langs het optische pad van de objectieflens terugkeren. In dit geval is een dichroïsche spiegel vereist om het excitatielicht te filteren. , alleen de fluorescentie doorlatend die we nodig hebben om door te kijken.
Deze fluorescentie bereikt het oculair langs het lichtpad van de microscoop en komt dan in onze ogen, waar we de fluorescentie kunnen zien die wordt uitgezonden door de fluorofoor.
Voorcontrole en afstelling van de fluorescentiemicroscoop:
(1) Vóór elke fluorescentiewaarneming is het noodzakelijk om routinematig de gloeidraaduitlijning, optische padfocus, apertuurdiafragma en velddiafragma-instellingen van het fluorescentieapparaat te controleren.
(2) Of het vereiste fluorescentie-excitatie-/emissiefiltersamenstel in de converter is geïnstalleerd, of de objectieflens van de fluorescentiemicroscoop correct is geconfigureerd en verwijder de olievlekken en stof op de voorste lens van de objectieflens.
(3) Als tegelijkertijd fasecontrastwaarneming van doorvallend licht wordt uitgevoerd, is het noodzakelijk om de conjugatie van het midden van de condensor en de fasecontrastring tegenover de objectieflens te controleren.
(4) Controleer of de monsterdrager (schuifglas, dekglas en andere gebruiksvoorwerpen) bedekt is met vloeistof of stof, en of de dikte binnen het gekalibreerde werkafstandsbereik van de objectieflens ligt. Het gesneden monster mag niet te dik zijn, bij voorkeur kleiner dan of gelijk aan 10 μm.
(5) Omdat de lichtbron ultraviolette stralen bevat, wordt een bruine lichtafschermende plaat boven de voorkant van het podium geplaatst om te voorkomen dat ultraviolette stralen het netvlies beschadigen.
(6) Spanningsinstabiliteit verkort de levensduur van de hogedrukkwiklamp en de lichtbronvoeding is uitgerust met een spanningsstabilisator.
(7) Om de levensduur van de kwiklamp te verlengen, kan deze 15 minuten na het inschakelen worden uitgeschakeld; zodra het fluorescerende vermogen van de kwiklamp is uitgeschakeld, moet het minstens 10 minuten wachten om de kwikdamp opnieuw te starten om af te koelen en terug te keren naar de oorspronkelijke staat, anders wordt de levensduur van de lamp beïnvloed.
Beeldwaarneming door fluorescentiemicroscoop:
(1) Ongeveer 5-10 minuten nadat de fluorescerende lichtbron is ingeschakeld, is de intensiteit van het excitatielicht stabiel en wordt het monster geladen voor observatie; om te voorkomen dat de fluorescentie van het monster wordt uitgedoofd door overmatig excitatielicht tijdens het scherpstellen en zoeken naar objecten, zoomt u eerst de fluorescentiemicroscoop uit Pas het excitatielicht aan tot een matige intensiteit met een diafragma of voeg een ND-filter toe, en verplaats de sample stage regelmatig. Nadat u het spiegelbeeld hebt bevestigd, past u het aan naar de fluorescerende toestand voor fotograferen en opnemen.
(2) Aanpassingen voor slechte beeldkwaliteit. Naast de factoren voor monstervoorbereiding zijn de noodzakelijke aanpassingen die kunnen worden aangebracht:
① Sluit lichtafschermende of lichtbeperkende apparaten uit in het optische beeldpad, zoals DIC-accessoires, ND-filters, enz.
②Pas de focus van de ontvanger en de grootte van het diafragma van de fluorescentiemicroscoop opnieuw aan.
③ Pas de correctiering voor het dekkingsverschil van de objectieflens van de fluorescentiemicroscoop voorzichtig aan.
Toepassingspunten van fluorescentiemicroscopie
Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van beeldvorming met "actinische fluorescentie". Als de geselecteerde excitatiegolflengte in het bijna-ultraviolette gebied (320-400nm) ligt, wat onzichtbaar is voor het blote oog, is het emissiespectrum van fluorescentie ook korter dan de gemiddelde golflengte van gewone lichtspiegellichtbronnen. verbeteren. Hoogenergetische fotonen botsen met elektronen, waardoor de elektronen overgaan van de grondtoestand naar de aangeslagen toestand. De elektronen in de aangeslagen toestand zijn zeer onstabiel en zullen terugvallen naar de grondtoestand. Hierbij wordt een deel van de thermische energie verbruikt en worden nieuwe fotonen uitgezonden. Het nieuwe foton heeft een lagere energie dan het oorspronkelijke foton en heeft daardoor een langere golflengte. Omdat de nieuwe fotongolflengte verschilt van de fotongolflengte van het invallende licht, worden de twee lichtbundels met verschillende golflengten gescheiden door een bepaalde optische verwerkingsmethode, zodat we alleen de uitgezonden nieuwe fotonen zien (fluorescentiesignaal), dat wil zeggen, de fluorescentiemicroscoop ziet fluorescentiebeelden.
