Hoe u de juiste fluorescentiemicroscoop kiest
Fluorescentiemicroscoop is een standaard microscopische beeldvormingsapparatuur in laboratoria en pathologieafdelingen, die fluorescentiekarakteristieken gebruikt voor observatie en beeldvorming. Het wordt veel gebruikt op verschillende gebieden, zoals celbiologie, neurobiologie, plantkunde, microbiologie, pathologie, genetica, enz. Fluorescentiebeeldvorming heeft de voordelen van hoge gevoeligheid en specificiteit, waardoor het zeer geschikt is voor het observeren van de distributie van specifieke eiwitten, organellen, enz. in weefsels en cellen, het bestuderen van co-lokalisatie en interacties, het volgen van levensdynamische processen zoals veranderingen in de ionenconcentratie, enzovoort.
Selectie van microscopen
Fluorescentiemicroscopen worden grofweg in drie categorieën onderverdeeld: rechtopstaande fluorescentiemicroscopen (geschikt voor slicen), omgekeerde fluorescentiemicroscopen (geschikt voor levende cellen maar ook voor slicen) en stereofluorescentiemicroscopen (geschikt voor grotere exemplaren, zoals planten, zebravissen (volwassen/ embryonaal), kwal, muizen-/rattenorganen, enz.).
Selectie van fluorescerende filterblokken
Bij de selectie van filterblokken moet niet alleen rekening worden gehouden met de excitatie- en emissiegolflengten van fluorescerende probes, maar ook met de vraag of er sprake is van niet-specifieke excitatie en of er sprake is van kleuroverspraak voor meerkleurig gelabelde monsters. In het experiment zullen we voor excitatie zoveel mogelijk de golflengte kiezen die het dichtst bij de excitatiepiek ligt, en het ontvangstbereik moet de piekemissie omvatten. De excitatiepiek van Alexa Fluor 488 is 500 nm, en in een fluorescentiemicroscoop kan een 480/40 excitatiefilter worden geselecteerd. De veelgebruikte fluorescerende filterblokken bij fluorescentiemicroscopie kunnen in twee typen worden verdeeld: lange doorlaat (LP) en banddoorlaat (BP), die ook op basis van de behoeften moeten worden geselecteerd.
Confocale microscoop
Bij traditionele fluorescentiemicroscopiewaarnemingen zijn ze, als gevolg van de overlap van fluorescerend gelabelde stoffen en spontane fluorescentiestructuren, nauw met elkaar verbonden. Traditionele vallende fluorescentiemicroscopieobjectieven verzamelen echter niet alleen licht uit het brandpuntsvlak, maar verspreiden ook licht naar boven en beneden in het brandpuntsvlak, wat resulteert in een aanzienlijke vermindering van de beeldresolutie en het contrast.
Confocale beeldvorming detecteert alleen het licht dat wordt gereflecteerd door het zelffocusserende vlak, waardoor het bovenstaande probleem wordt opgelost. De lichtbron vormt via een gaatje een kleine en fijne plek op het brandpuntsvlak, en het licht dat door het brandpuntsvlak wordt uitgezonden, wordt opgevangen door de objectieflens. Het grootste deel van de fluorescentie die wordt uitgezonden door punten boven of onder het brandpuntsvlak van de objectieflens kan niet naar het gaatje convergeren. Alleen de fluorescentie die zich in het brandpuntsvlak bevindt en een klein deel van de onscherpe fluorescentie kunnen door het gaatje gaan, terwijl de lichtbundel buiten het brandpuntsvlak voor of achter de gaatjesplaat convergeert en wordt geblokkeerd om via het gaatje de detector binnen te gaan. Het gedetecteerde beeld komt uit het brandpuntsvlak, waardoor de uiteindelijke beeldkwaliteit aanzienlijk wordt verbeterd.
Vanwege de verschillende voordelen en bruikbaarheid van confocale microscopie met laserscanning, is het momenteel een onmisbare experimentele assistent op het gebied van uiterst nauwkeurige celbiologie, plantkunde en celonderzoek. Tegelijkertijd zal dit in toekomstige wetenschappelijke onderzoekscentra het meest fundamentele onderzoeksinstrument zijn.
