Inleiding tot fluorescentiemicroscopie
Fluorescentiemicroscopie is het bestralen van het met fluoresceïne gekleurde object met licht met een korte golflengte, zodat het wordt geëxciteerd om fluorescentie met een lange golflengte te produceren en vervolgens wordt waargenomen. In een fluorescentiemicroscoop moet het excitatielicht van een specifieke golflengte worden geselecteerd uit het verlichtingslicht van het monster om fluorescentie te genereren, en vervolgens moet de fluorescentie worden gescheiden van het gemengde licht van het excitatielicht en fluorescentie voor observatie. Daarom speelt het filtersysteem een uiterst belangrijke rol bij het selecteren van een specifieke golflengte. Fluorescentiemicroscopen worden veel gebruikt in de biologie, geneeskunde en andere gebieden.
1. De belangrijkste componenten van de fluorescentiemicroscoop:
(A) Lichtbron: De lichtbron straalt licht uit met verschillende golflengten (van ultraviolet tot infrarood). de
(B) Excitatiefilterlichtbron: door het licht van een specifieke golflengte dat ervoor kan zorgen dat het monster fluorescentie produceert, terwijl licht wordt geblokkeerd dat nutteloos is voor opwindende fluorescentie. de
(C) Fluorescerende exemplaren: over het algemeen gekleurd met fluorescerende pigmenten. de
(D) Blokkeerfilter: blokkeer het excitatielicht dat niet door het monster wordt geabsorbeerd en breng selectief de fluorescentie over, en sommige golflengten worden selectief overgedragen in de fluorescentie.
de
2. Classificatie van fluorescentiemicroscopen:
Fluorescentiemicroscopen worden over het algemeen in twee typen verdeeld: transmissie en epi-emissie:
A. Transmissietype: het excitatielicht komt van de onderkant van het te inspecteren object en de condensor is een donkerveldcondensor, zodat het excitatielicht niet in de objectieflens komt, maar de fluorescentie in de objectieflens. Het is helder bij lage vergrotingen, maar donker bij hoge vergrotingen. Het is moeilijk om in olie-onderdompeling en centrering te werken. Het is vooral moeilijk om het verlichtingsbereik te bepalen bij lage vergrotingen, maar het kan een zeer donkere gezichtsveldachtergrond krijgen. Het transmissietype wordt niet gebruikt voor niet-transparante objecten. de
B. Epi-type: het transmissietype is momenteel bijna geëlimineerd. De meeste nieuwe fluorescentiemicroscopen zijn van het epitype. De lichtbron komt van boven het te inspecteren object en er zit een bundelsplitser in het optische pad, dus geschikt voor zowel transparante als ondoorzichtige te inspecteren objecten. Omdat de objectieflens als condensorlens fungeert, is hij niet alleen eenvoudig te bedienen, maar kan hij ook een uniforme verlichting van het gehele gezichtsveld bereiken, van lage vergroting tot hoge vergroting. de
de
3. Voorzorgsmaatregelen voor fluoroscopie
A. Langdurige bestraling van excitatielicht zal fluorescentieverzwakking en uitdoving veroorzaken, dus verkort de observatietijd zo veel mogelijk en gebruik een schot om het excitatielicht te bedekken wanneer u tijdelijk niet observeert. de
B. Gebruik bij het observeren met een olie-immersielens "niet-fluorescerende olie". de
C. Fluorescentie is bijna altijd zwak en moet in een donkere kamer worden uitgevoerd. de
D. Het is het beste om een spanningsstabilisator in de voeding te installeren, anders zal de onstabiele spanning niet alleen de levensduur van de kwiklamp verkorten, maar ook het effect van de microscoopinspectie beïnvloeden. de
de
4. Gebruik van fluorescentiemicroscopie
1. Voorbereidingsvereisten voor fluorescentiemicroscoopspecimens
A. Glazen glijbaan
De dikte van het glasplaatje moet tussen 0,8 en 1,2 mm liggen. Een te dik objectglaasje zal enerzijds meer licht absorberen en anderzijds kan het excitatielicht niet op het preparaat geconcentreerd worden. Objectglaasjes moeten glad zijn, een uniforme dikte hebben en vrij zijn van duidelijke autofluorescentie. Soms worden objectglaasjes van kwartsglas gebruikt. de
B. Afdekglas
De dikte van het afdekglas is ongeveer 0.17 mm, glad. Om het excitatielicht te versterken, kan ook een droog dekglas worden gebruikt. fluorescentie soepel verlopen. Excitatielicht wordt doorgelaten en het gereflecteerde excitatielicht prikkelt het preparaat. de
C. Exemplaar
Plakjes weefsel of andere monsters mogen niet te dik zijn. Als het te dik is, zal het meeste excitatielicht worden verbruikt in het onderste deel van het preparaat, terwijl het bovenste deel dat direct wordt waargenomen door de objectieflens niet volledig kan worden geëxciteerd. Bovendien verdoezelen celoverlappingen of onzuiverheden het oordeel. de
D. Montagemiddel
Glycerine wordt vaak gebruikt als bevestigingsmiddel, dat geen autofluorescentie mag hebben, kleurloos en transparant is, en de helderheid van de fluorescentie is helderder bij pH 8.5-9.5, en het is niet gemakkelijk om snel te vervagen. Daarom wordt gewoonlijk een gelijk mengsel van glycerol en 0,5mol/L carbonaatbufferoplossing met een pH van 9,{6}} tot 9,5 gebruikt als bindmiddel. de
e. spiegel olie
Over het algemeen moet immersie-olie worden gebruikt bij het observeren van monsters met donkerveldfluorescentiemicroscopen en immersie-objectieven voor olie-immersie. Het is het beste om speciale niet-fluorescerende spiegelolie te gebruiken, die ook kan worden vervangen door de bovengenoemde glycerine, en vloeibare paraffine kan ook worden gebruikt, maar de brekingsindex is laag, wat de beeldkwaliteit enigszins beïnvloedt.
