Voordelen van laserscanning met multifotonmicroscopie verbeterd
Laserscannende multi-fotonenmicroscoop is een belangrijke verbetering in de optische microscopie, voornamelijk wat betreft het vermogen om de diepe structuur van levende en gefixeerde cellen en weefsels waar te nemen, en om heldere en scherpe meerlaagse Z-vlakstructuren te verkrijgen, dat wil zeggen optische plakjes, waaruit er kan een driedimensionale vaste structuur van het monster worden geconstrueerd. Confocale microscopie maakt gebruik van een laserlichtbron die wordt uitgezet om het gehele achterste brandpuntsvlak van de objectieflens te vullen, en vervolgens door het lenssysteem van de objectieflens gaat om te convergeren naar zeer kleine plekken op het brandpuntsvlak van het monster. Afhankelijk van de numerieke opening van de objectieflens is de grootte van de heldere verlichtingspuntdiameter ongeveer 0.25 ~ 0.8 μm en de diepte ongeveer 0.5 ~ 1.5 urn De grootte van het confocale punt wordt bepaald door het ontwerp van de microscoop, de lasergolflengte, de kenmerken van de objectieflens, de toestandsinstelling van de scaneenheid en de aard van het preparaat. Veldmicroscopen hebben een groot verlichtingsbereik en een grote verlichtingsdiepte, terwijl confocale microscopen de verlichting concentreren op een enkel brandpunt op het brandpuntsvlak. Het meest fundamentele voordeel van een confocale microscoop is de mogelijkheid om fijne optische secties te maken van dikke fluorescerende monsters (tot 50 μm of meer), met sectiediktes van ongeveer 0,5 tot 1,5 μm. Een reeks optische doorsnedebeelden kan worden verkregen door het preparaat op en neer te bewegen met de Z-as stappenmotor van de microscoop. De verwerving van beeldinformatie wordt bestuurd in het eerste vlak en wordt niet verstoord door signalen die worden uitgezonden vanaf andere locaties op het preparaat. Na het verwijderen van de effecten van achtergrondfluorescentie en het verhogen van de signaal-ruisverhouding, zijn het contrast en de resolutie van het confocale beeld aanzienlijk verbeterd ten opzichte van conventionele veldbelichte fluorescentiebeelden. In veel exemplaren zijn veel ingewikkelde structurele componenten met elkaar verweven om complexe systemen te vormen, maar zodra er voldoende optische secties kunnen worden verkregen, kunnen we ze met behulp van software in drie dimensies reconstrueren. Deze experimentele methode wordt veel gebruikt in biologisch onderzoek om de complexe structurele en functionele relaties tussen cellen of weefsels op te helderen.
