Microscopisch beeldvormend klaslokaal丨Toepassing van fluorescentiemicroscopie
Totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) is een techniek die gebruik maakt van de verdwijnende golf die wordt gegenereerd door een lichtstraal die zich voortplant tussen twee verschillende brekingsindexmedia om het oppervlak van fluorescerend gelabelde levende cellen te onderzoeken. Wanneer een invallende laserstraal in de praktijk het grensvlak tussen het dekglaasje en het waterige medium dat de cellen bevat, tegenkomt, wordt deze in de kritische hoek gereflecteerd (totale interne reflectie). Omdat de energie van de verdwijnende golf exponentieel afneemt met de afstand tot het dekglaasje, worden alleen fluoroforen binnen 10 nanometer van het oppervlak (tussen 10 en 200 nanometer) geëxciteerd door de verdwijnende golf, terwijl fluoroforen verder weg grotendeels niet opgewonden zijn. Aangetast. TIRFM resulteert dus in hoge signaalniveaus van fluoroforen die zich in de buurt van het dekglaasje bevinden, bovenop een zeer donkere achtergrond, wat een uitstekende signaal-ruisverhouding oplevert. De extreme beperking van de excitatiediepte is ideaal voor het bestuderen van enkele moleculen of de samenstelling van membranen en organellen in hechtende cellen nabij het oppervlak van het dekglaasje (zie figuur 8(e)). Aangezien excitatie beperkt is tot dunne gebieden in de buurt van het dekglaasje, zijn fotobleken en fototoxiciteit ook beperkt tot deze regio's, waardoor TIRFM een van de meest bruikbare methoden is voor langetermijnobservatie. De techniek is een fundamenteel hulpmiddel geworden voor het bestuderen van een breed scala aan fenomenen in de cel- en moleculaire biologie.
Deconvolutie is een algoritme dat wordt toegepast op een reeks afbeeldingen met alle focus die zijn verkregen langs de optische (Z) as om het fotonsignaal in een stapel afbeeldingen voor een bepaald beeldvlak of meerdere brandpuntsvlakken te verbeteren. Microscopen moeten worden uitgerust met uiterst nauwkeurige gemotoriseerde focusaandrijvingen om beeldacquisitie op nauwkeurig gedefinieerde intervallen tussen de brandvlakken van het monster te garanderen. In een typische toepassing (zie Fig. 8(f)) wordt het deconvolutieproces gebruikt om onscherp licht uit een bepaald brandvlak te deblurren en te verwijderen met behulp van breedveldfluorescentie-excitatie en -emissie. De meest complexe toepassing is om het deconvolutieproces toe te passen op de gehele afbeeldingsstapel om geprojecteerde weergaven of 3D-modellen te genereren. Een reeks breedbeeldbeelden die voor deconvolutie worden gebruikt, legt het theoretische maximale aantal fotonen vast dat door het monster wordt uitgezonden. Het deconvolutieproces herverdeelt de "wazige" intensiteiten van fotonen die boven en onder het brandvlak worden uitgezonden, terug naar het oorspronkelijke vlak. Deconvolutie gebruikt dus bijna alle beschikbare emissie-intensiteiten en biedt een optimaal lichtbudget, waardoor deze techniek de voorkeursmethode is voor zeer lichtgevoelige monsters.
Een variant van het resonantie-energieoverdrachtsfenomeen op fluorescentiemicroscopie, fluorescentie of Förster-resonantie-energieoverdracht (FRET) wordt gebruikt om kwantitatieve temporele en ruimtelijke informatie te verkrijgen over de binding en interactie van eiwitten, lipiden, enzymen en nucleïnezuren in levende cellen. FRET kan technieken met een constante toestand of tijdsopgeloste technieken gebruiken, maar tijdsopgeloste FRET-beeldvorming heeft het voordeel dat donor-acceptorafstanden nauwkeuriger in kaart worden gebracht. Een standaard breedveldfluorescentiemicroscoop uitgerust met geschikte excitatie- en emissiefilters en een gevoelige camera kunnen worden gebruikt voor FRET-beeldvorming. Biosensoren die een milieugevoelig eiwit of peptide tussen twee FRET-toepasbare fluorescerende eiwitten klemmen, worden momenteel veel gebruikt in de celbiologie. Deze sondes kunnen gemakkelijk worden afgebeeld onder breedveldfluorescentiemicroscopie met behulp van FRET-technieken met gesensibiliseerde emissie in combinatie met ratiometrische analyse. Bovendien kunnen spectrale beeldvorming en lineaire ontmenging met behulp van confocale laserscanningmicroscopie helpen bij het volgen van FRET-verschijnselen in biosensoren en andere toepassingen van fluorescerend eiwit.
Fluorescentielevensduur beeldvormingsmicroscopie (FLIM) is een geavanceerde techniek die in staat is om tegelijkertijd de fluorescentielevensduur en de ruimtelijke locatie van een fluorofoor op elke locatie in het beeld vast te leggen. Deze methode biedt een mechanisme om omgevingsparameters zoals pH, ionische concentratie, oplosmiddelpolariteit, niet-covalente interacties, viscositeit en zuurstofspanning in enkele levende cellen te bestuderen en presenteert de gegevens in ruimtelijke en temporele arrays. FLIM-metingen van levensduren in aangeslagen toestanden op de schaal van nanoseconden zijn onafhankelijk van lokale fluorofoorconcentraties, fotobleekeffecten en padlengte (monsterdikte), maar zijn gevoelig voor reacties in aangeslagen toestanden zoals resonantie-energieoverdracht. Het combineren van FLIM met FRET door de levensveranderingen van fluorescerende donoren voor en na resonantie-energieoverdracht te volgen, wordt zelfs beschouwd als een van de beste manieren om dit fenomeen te bestuderen.
De mobiliteit (transversale diffusiecoëfficiënt) van fluorescent gelabelde macromoleculen en kleine fluoroforen kan worden bepaald door fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) techniek. Bij FRAP wordt een zeer klein geselecteerd gebied (een paar micrometer in diameter) intens verlicht, meestal met een laser, om de fluorofoor in dat gebied volledig te bleken. Het resultaat is een dramatische vermindering of vernietiging van fluorescentie. Na een fotobleekpuls werden de snelheid en mate van herstel van de fluorescentie-intensiteit in gebleekte gebieden gevolgd als een functie van de tijd bij lage excitatie-intensiteiten om informatie te genereren over de kinetiek van herbevolking en herstel van fluorofoor (Figuur 9). FRAP wordt meestal uitgevoerd met behulp van EGFP of andere fluorescerende eiwitten. Gerelateerde fotoactiveringstechnieken zijn gebaseerd op speciale synthetische gekooide fluoroforen of soortgelijke functionele fluorescerende eiwitten die kunnen worden geactiveerd door korte pulsen van UV of violet. Fotoactivatie en FRAP kunnen worden gebruikt als aanvullende technieken om mobiliteitsparameters te bepalen.
In een techniek die verband houdt met FRAP, fluorescentieverlies na fotobleken (FLIP) genoemd, ondergaat een gedefinieerd fluorescerend gebied in een levende cel herhaaldelijk fotobleken door intense bestraling. Als alle fluoroforen zouden kunnen diffunderen in het gebied dat wordt gefotobleekt gedurende de gemeten tijdsperiode, zou dit resulteren in een volledig verlies van fluorescentiesignaal door de cel. Door de snelheid te berekenen waarmee de fluorescentie uit de gehele cel verdwijnt, kan de diffusiemobiliteit van de beoogde fluorofoor worden bepaald. Bovendien kan FLIP gemakkelijk de locatie en aard van eventuele diffusiebarrières tussen individuele compartimenten van cellen identificeren, zoals de barrière tussen de soma en het axon van een neuron.
Fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS), voornamelijk gebruikt bij confocale microscopie met laserscanning of multifotonenmicroscopie, is een methode die is ontworpen om kinetische informatie te bepalen, zoals chemische reactiesnelheden, diffusiecoëfficiënten, technieken voor molecuulgewicht, stroomsnelheid en aggregatie. Bij FCS wordt een klein volume (ongeveer één femtometer; de diffractie-beperkte focus van de laser) verlicht met een gefocusseerde laserstraal om fluctuaties in de autofluorescentie-intensiteit vast te leggen die worden veroorzaakt door de dynamiek van fluorescerende moleculen als een functie van de tijd in het volume dat wordt ingenomen door fluorescerend licht. moleculen (Fig. 10). Relatief kleine fluoroforen diffunderen snel in het verlichte volume en produceren korte uitbarstingen van willekeurige intensiteit. Omgekeerd bewegen grotere complexen (fluoroforen gebonden aan macromoleculen) langzamer, waardoor langere, meer aanhoudende tijdsafhankelijke patronen van fluorescentie-intensiteit worden geproduceerd.
Wanneer fluorescerend gelabelde structuren dicht opeengepakt zijn en elkaar overlappen in specifieke gebieden van levende cellen, zijn hun dynamiek en ruimtelijke verdeling moeilijk te analyseren. Fluorescentievlekmicroscopie (FSM) is een techniek die compatibel is met bijna alle beeldvormende modaliteiten die gebruik maakt van zeer lage concentraties van fluorescerend gelabelde subeenheden, onscherpe fluorescentie vermindert en de zichtbaarheid van gelabelde structuren en hun dynamiek in dikke gebieden verbetert. FSM's worden geïmplementeerd door slechts een fractie van de gehele interessante structuur te labelen. In die zin is FSM vergelijkbaar met het uitvoeren van FCS over het gehele gezichtsveld, hoewel het meer nadruk legt op ruimtelijke patronen dan op kwantitatieve temporele analyse. Fluorescerende spotmicroscopie is bijzonder nuttig bij het bepalen van de mobiliteit en aggregatie van cytoskeletelementen zoals actine en microtubuli in hyperactieve cellen.
Gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED) is een opkomende superresolutietechniek met een ruimtelijke resolutie die ver boven de diffractielimiet ligt, waarbij ringvormig verarmd licht wordt gebruikt om een kleinere bundel excitatielicht te omringen om sub{2} nm op de as te verkrijgen de resolutie. De techniek is gebaseerd op excitatie van fluoroforen met gesynchroniseerde laserpulsen en ruimtelijk gecoördineerde circulaire STED-pulsen die het uitgezonden licht uitputten, waardoor de fluorescentie van geëxciteerde moleculen rond de laserscanfocus wordt onderdrukt. Fluorescentie die aan de rand van de spot wordt gegenereerd, wordt onderdrukt, maar niet in het midden van de spot, waardoor de grootte van de fluorescerende spot aanzienlijk wordt verkleind en de resolutie dienovereenkomstig aanzienlijk wordt verhoogd. STED heeft bewezen een nuttig hulpmiddel te zijn voor detectie met hoge resolutie van levende cellen. Andere opkomende superresolutietechnieken, zoals foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) en gestructureerde lichtverlichtingsmicroscopie (SIM), zullen in de nabije toekomst ook fundamentele hulpmiddelen worden voor beeldvorming van levende cellen.
Het toenemende gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten en geavanceerde synthetische fluoroforen voor beeldvorming van levende cellen opent de deur naar nieuwe optische modaliteiten voor het bewaken van temporele dynamiek en ruimtelijke relaties. Microscopisten hebben nu een complete set hulpmiddelen om beeldgegevens van cellulaire processen die plaatsvinden over een breed scala aan tijdschalen en met meerdere resoluties te observeren en vast te leggen. Langzamere gebeurtenissen kunnen eenvoudig worden waargenomen en geregistreerd met behulp van laser scanning confocale microscopie, terwijl snellere kinetische gebeurtenissen kunnen worden verkregen met behulp van draaiende schijftechnologie. Bovendien maakt multifotonenmicroscopie diepe beeldvorming in dik weefsel mogelijk, en maken technieken voor totale interne reflectie het sonderen van membraanoppervlakken met confocale precisie mogelijk. Geavanceerde fluorescentiemethoden, zoals FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM en STED, kunnen worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te volgen met resoluties die vaak beter zijn dan die toegestaan door de diffractielimiet. Met de vooruitgang in fluorofoor-, microscoop- en detectortechnologie zal een grotere wereld "onder de microscoop" worden gebracht.
