Beeldvormingstechnologie met multifotonenmicroscopie: polarisatie-opgeloste tweede-harmonische generatiemicroscopie en de beeldverwerking ervan
In niet-lineaire optische microscopen wordt gewoonlijk beeldvorming van de tweede harmonische generatie (SHG) gebruikt om endogene vezelstructuren waar te nemen, en de intensiteit van SHG hangt grotendeels af van de relatieve hoek tussen de polarisatierichting van de invallende straal en de oriëntatieas van het doelmolecuul. Daarom kan op polarisatie gebaseerde SHG-beeldvorming (P-SHG) structurele informatie van doelmoleculen verkrijgen door de functionele relatie tussen SHG-signaalintensiteit en de polarisatietoestand van de invallende straal te analyseren. Het wordt nu gebruikt als een belangrijk hulpmiddel voor medische en biologische analyse.
Eenvoudige SHG-beelden kunnen worden verkregen via traditionele twee-fotonenexcitatiefluorescentiemicroscopie (TPM). De meeste TPM-systemen gebruiken nog steeds een scanmethode met één bundel, gebaseerd op een bewegende spiegel, waarvan de tijdresolutie afhangt van de fysieke bewegingssnelheid van de spiegel. Om snellere beeldvorming te bereiken, kan het TPM-systeem ook een scanmethode met meerdere bundels gebruiken (Figuur 1A), waarvan er één het gebruik is van een roterende schijfscaneenheid. Dit apparaat bestaat uit een coaxiale microlensdraaitafel en een pinhole-draaitafel, waarbij de microlenzen en pinholes op elke draaitafel één-met-één corresponderen.
Wanneer de laser door de microlensdraaitafel gaat, bedekt het golffront meerdere microlenzen. Verschillende microlenzen focusseren verschillende delen van het golffront op verschillende posities en gaan door overeenkomstige gaatjes, waardoor meerdere microbundels worden gevormd. Deze microstralen die het monster raken, kunnen tegelijkertijd meerdere signalen opwekken. Deze signalen keren terug langs het microscoopsysteem en passeren opnieuw het gaatje, en worden uiteindelijk door de dichroïsche spiegel tussen de twee draaitafels in het detectieapparaat gereflecteerd. De veelgebruikte modus-vergrendelde titanium-saffierlaser als lichtbron heeft echter onvoldoende energie, wat het aantal excitatiebundels beperkt en resulteert in een klein effectief gezichtsveld (FOV) voor TPM (TPM-SD) met behulp van een roterende scaneenheid.
Ai Goto et al. gericht op het bereiken van hoge-snelheid P-SHG-beeldvorming met een groot gezichtsveld (FOV) met behulp van het TPM-SD-systeem. Daarom werd een op Yb gebaseerde laserbron met een hoger piekvermogen in het TPM-SD-systeem geïntroduceerd.
Dit is een schematisch diagram van het TPM-SD-systeem dat ze hebben ontwikkeld. De lichtbron van het systeem is een op Yb gebaseerde laser, die femtosecondepulsen genereert met een centrale golflengte van 1042 nm, een gemiddeld vermogen van 4 W, een pulsbreedte van 300 fs en een herhalingssnelheid van 10 MHz. Het systeem past eerst het laservermogen aan via een halvegolfplaat en een Glan-laserpolarisator, en breidt vervolgens de straal uit via een straalexpander. De uitgezette straal wordt in de scaneenheid van de draaitafel geïntroduceerd en meerdere microbundels die uit de scaneenheid komen, worden gefocusseerd op meerdere punten van het monster via een objectieflens met waterimmersie. Om de polarisatietoestand van de lichtbundel bij de objectieflens aan te passen, worden een halve golfplaat en een kwartgolfplaat op het optische pad van de excitatiebundel geplaatst.
