Optische eigenschappen van biologische microscopen
De optische prestaties van de microscoop worden bepaald door de volgende acht fundamentele optische parameters (of parameters):
(1) Numerieke apertuur
Numerieke apertuur wordt ook wel spiegelverhouding genoemd. Het verwijst naar het product van de brekingsindex n van het medium tussen het waargenomen object en de lens en de sinuswaarde van de helft van de lenshoek van het objectief. Gebruik NA of A. om te vertegenwoordigen. NA=nsin( /2)
De zogenaamde spiegelmondhoek verwijst naar de hoek tussen de marginale stralen van het waargenomen punt die de frontlens van de objectieflens binnenkomen.
De numerieke apertuur is een belangrijke parameter van de objectieflens en de condensorlens en hangt nauw samen met andere optische parameters van de microscoop. Over het algemeen wordt gehoopt dat hoe groter hoe beter. Uit de formule blijkt dat er twee manieren zijn om de numerieke apertuur te vergroten, de ene is om de spiegelmondhoek te vergroten en de andere is om de brekingsindex tussen de objectieflens en het preparaat te vergroten.
Wanneer de eerste methode wordt toegepast, kunnen het specimen en het object zo dicht mogelijk bij elkaar worden gehouden. Maar hoe dichtbij ook, het is altijd minder dan 180 graden. Sin( /2) is dus ook kleiner dan 1. De brekingsindex van lucht is n=1. Daarom is de numerieke apertuur nsin(/2) van de droge objectieflens altijd kleiner dan 1, in het algemeen tussen 0.04 en 0.95.
Wanneer de laatste methode wordt toegepast, kan een medium met een hogere brekingsindex worden toegevoegd tussen de objectieflens en het preparaat. De brekingsindex van cederolie is bijvoorbeeld n=1.515. Wanneer cederolie als medium wordt gebruikt, kan de numerieke apertuur meer dan 1,2 bereiken. Daarom wordt in sommige gevallen een oliebril gebruikt. Op dit moment is het maximale numerieke diafragma dat de olielens kan bereiken 1,4.
(2) Resolutie
Resolutie wordt ook wel discriminatiegraad of oplossend vermogen genoemd. De zogenaamde resolutie verwijst naar het vermogen van de microscoop om de fijne structuur van het te inspecteren object te onderscheiden. Het is omgekeerd evenredig met de resolutieafstand. De resolutieafstand verwijst naar de minimale afstand tussen twee objectpunten die kunnen worden onderscheiden. Hoe kleiner de oplossende afstand, hoe hoger de resolutie van de microscoop. Als de afstand tussen twee objectpunten kleiner is dan de resolutieafstand, worden de twee punten aangezien voor één punt en is de structuur ervan niet duidelijk te zien. De resolutie van de microscoop wordt bepaald door de objectieflens. Oculairs vergroten alleen en verhogen niet de resolutie van de microscoop.
Bij normale centrale verlichting wordt de oplossende afstand d van de objectieflens bepaald door de volgende formule.
d=(λ/2)N.A.
In de formule: d staat voor de resolutieafstand, de eenheid is micron, λ staat voor de golflengte van het verlichtingslicht, de eenheid is ook micron.
In zichtbaar licht is de golflengte met de grootste helderheid en de meeste gevoeligheid voor menselijke ogen {{0}}.55 μm, en de maximale NA van de objectieflens is 1,4. Substitueren in de bovenstaande formule, d is ongeveer 0.2 μm. Dat wil zeggen, met een gewone optische microscoop is de limiet van de resolutieafstand 0.2 μm in het geval van centrale verlichting. Dat wil zeggen dat gewone optische microscopen geen onderscheid kunnen maken tussen twee objecten die kleiner zijn dan 0,2 μm.
Met behulp van ultraviolet licht kan de golflengte van het verlichtingslicht worden verkleind, waardoor de resolutieafstand 0.1 μm kan bereiken. Maar ultraviolette stralen kunnen niet door het menselijk oog worden gezien. Het kan alleen worden waargenomen na het maken van een foto.
De golflengte van de elektronenstroom is slechts 0.00387nm. Met behulp van "elektronenlens" of magnetische lens om de stroom van elektronen te regelen, is de resolutieafstand van de elektronenmicroscoop tot enkele tienden van een nanometer. Het kan worden gebruikt om de structuur van atomen te observeren.
(3) Vergroting
De vergroting van de microscoop is gelijk aan het product van de vergroting van de objectieflens en de vergroting van het oculair. In principe kan de vergroting zeer groot worden gemaakt. Als de details van het preparaat echter niet kunnen worden opgelost door de objectieflens, hoe groot de vergroting ook is, is dit zinloos. Theoretisch kan worden afgeleid dat de meest geschikte vergroting van de microscoop (de effectieve vergroting genoemd, effectief weergegeven door M) tussen de 500 en 1000 keer de numerieke apertuur van de objectieflens is. Dat wil zeggen, 500N.A. Minder dan of gelijk aan M effectief Minder dan of gelijk aan 1000N.A.
Binnen het effectieve vergrotingsbereik kunnen de ogen langdurig observeren zonder vermoeid te raken. Als de vergroting lager is dan 500 NA, is het moeilijk waar te nemen. Als het hoger is dan 1000N.A., zal het de beeldkwaliteit verslechteren en zelfs een onwerkelijk beeld veroorzaken. Daarom is de vergroting van meer dan 1000N.A. wordt ongeldige vergroting genoemd.
(4) Werkafstand
De werkafstand verwijst naar de afstand tussen het onderoppervlak van de objectieflens en het bovenoppervlak van het dekglas nadat de microscoop is scherpgesteld, met behulp van een standaard dekglas en een standaard mechanische buislengte. Hoe hoger de vergroting van de objectieflens, hoe korter de werkafstand. Over het algemeen is de werkafstand van de low-power objectieflens minder dan 10 keer 5-7 mm, terwijl de werkafstand van de 100 keer olielens slechts ongeveer 0,19 mm is.
(5) Scherptediepte
Wanneer de microscoop wordt gefocusseerd op een bepaald vlak in het preparaat, is niet alleen het objectvlak duidelijk te zien, maar zijn ook de bovenste en onderste objectvlakken die ermee verbonden zijn tegelijkertijd duidelijk te zien. De afstand tussen de bovenste en onderste objectvlakken wordt de scherptediepte of kortweg de scherptediepte genoemd.
De scherptediepte van de microscoop is erg klein, en hoe groter de numerieke apertuur, hoe groter de totale vergroting en hoe kleiner de scherptediepte. Als u bijvoorbeeld een olielens gebruikt met een NA van 1,25/100 keer en een 12,5 keer oculair om te observeren, is de scherptediepte slechts 0,27 μm. Dat wil zeggen, na het scherpstellen is per keer slechts een dun laagje van 0,27 μm dik duidelijk te zien. Gewone exemplaren zijn over het algemeen enkele microns dik. Om het hele preparaat te zien, is het nodig om het fijnafstellingsmechanisme van de microscoop te gebruiken om in lagen van boven naar beneden te observeren.
(6) gezichtsveld
Het gezichtsveld wordt ook wel het gezichtsveld genoemd. Verwijst naar de reikwijdte van het te inspecteren object dat de microscoop in één keer kan zien. Meestal willen we dat het gezichtsveld zo groot mogelijk is. Het gezichtsveld van de microscoop wordt bepaald door het gezichtsveld van de objectieflens en het gezichtsveld van het oculair. Het gezichtsveld van een gewone objectieflens is minder dan 20 mm en de grote kan meer dan 40 mm bereiken. Het gezichtsveld van gewone 10x-oculairs is 14 mm en de grote kunnen meer dan 24 mm bereiken. Zodra het objectief en het oculair zijn ontworpen, staat hun gezichtsveld vast. Omdat het gezichtsveld van een algemene microscoop klein is, is het onmogelijk om het hele preparaat in één gezichtsveld te zien, er is slechts een heel klein cirkeltje op het preparaat te zien. Bovendien is de grootte van het gezichtsveld omgekeerd evenredig met de totale vergroting van de microscoop. Hoe groter de totale vergroting, hoe kleiner het gezichtsveld. De oplossing is om de verhuizer te gebruiken om elk deel van het monster beurtelings in het gezichtsveld te laten komen en beurtelings te observeren.
(7) Spiegelhelderheid
Spiegelhelderheid verwijst naar de lichtheid en duisternis van het objectbeeld gezien in de microscoop. Om observatie te vergemakkelijken, hopen we dat het resulterende beeld helderder is. Bij constant extern licht is de spiegelhelderheid evenredig met het kwadraat van de numerieke apertuur en omgekeerd evenredig met het kwadraat van de totale vergroting. Om het beeld helderder te maken, moet een objectieflens met een groot numeriek diafragma worden gebruikt met een oculair met een lage vergroting. In het geval van dezelfde objectieflens zal het gebruik van een 5X-oculair bijvoorbeeld een spiegelbeeld produceren dat 4 keer helderder is dan het gebruik van een 10X-oculair.
Voor microscopen die elektrische lichtbronnen gebruiken, kan de helderheid van het spiegelbeeld worden geregeld door de helderheid van de illuminator aan te passen.
(8) Duidelijkheid
De helderheid van microscoopbeeldvorming hangt af van het optische systeem, met name de optische prestaties van de objectieflens. Het is gerelateerd aan het ontwerp, de fabricage, het gebruik en de opslag van microscopen. Het is een belangrijk en complex vraagstuk. Vanuit het oogpunt van gebruik en opslag zijn de belangrijkste redenen die van invloed zijn op de helderheid: de dikte van het gebruikte dekglas is niet gekwalificeerd, de focus is niet ingesteld op de ideale positie, de totale vergroting is te groot en de lens van de olie lens wordt niet gewist. Schoon, lens schimmel, etc.
