Principe en toepassing van fluorescentiemicroscopie
(1) Het principe en de structurele kenmerken van de fluorescentiemicroscoop: de fluorescentiemicroscoop gebruikt een puntlichtbron met een hoge lichtopbrengst om licht van een bepaalde golflengte uit te zenden (zoals ultraviolet licht 3650 inch of paarsblauw licht 4200 inch) door het filtersysteem als opwindingslicht om het specimen op te wekken. Nadat de fluorescerende substantie binnenin fluorescentie van verschillende kleuren uitzendt, wordt deze waargenomen door de vergroting van de objectieflens en het oculair. Op deze manier is het onder een sterke contrastachtergrond, zelfs als de fluorescentie erg zwak is, gemakkelijk te identificeren en heeft het een hoge gevoeligheid. Het wordt voornamelijk gebruikt voor het onderzoek naar celstructuur en -functie en chemische samenstelling. De basisstructuur van een fluorescentiemicroscoop bestaat uit een gewone optische microscoop plus enkele accessoires (zoals een fluorescerende lichtbron, een excitatiefilter, een tweekleurenbundelsplitser en een blokkeerfilter, enz.). TL-lichtbron - gebruik over het algemeen een ultrahogedrukkwiklamp (50-200W), die licht van verschillende golflengten kan uitzenden, maar elke fluorescerende substantie heeft een excitatiegolflengte die de sterkste fluorescentie produceert, dus het is noodzakelijk om een excitatiefilter (over het algemeen zijn er ultraviolette, paarse, blauwe en groene excitatiefilters), die alleen excitatielicht van een bepaalde golflengte doorlaten en het monster bestralen, terwijl ze ander licht absorberen. Nadat elke stof is bestraald met excitatielicht, zendt deze in zeer korte tijd zichtbare fluorescentie uit met een langere golflengte dan de bestralingsgolflengte. Fluorescentie is specifiek en over het algemeen zwakker dan excitatielicht. Om specifieke fluorescentie waar te nemen, is een blokkerend (of onderdrukkend) filter nodig achter de objectieflens. Het heeft twee functies: de ene is om het excitatielicht te absorberen en te blokkeren om het oculair binnen te gaan, om de fluorescentie niet te verstoren en de ogen te beschadigen; de andere is om de specifieke fluorescentie te selecteren en door te laten, waarbij een specifieke fluorescerende kleur wordt weergegeven. De twee filters moeten samen worden gebruikt.
Er zijn twee soorten fluorescentiemicroscopen in termen van hun optische paden:
1. Transmissie-fluorescentiemicroscoop: de excitatielichtbron wekt fluorescentie op door het monstermateriaal door de condensorlens. Gewoonlijk wordt een donkerveldcollector gebruikt en een gewone collector kan ook worden gebruikt om de spiegel zo af te stellen dat het excitatielicht wordt doorgelaten en omgeleid naar het preparaat. Dit is een ouderwetse fluorescentiemicroscoop. Het voordeel is dat de fluorescentie sterk is bij een lage vergroting, en het nadeel is dat de fluorescentie afneemt met toenemende vergroting. Daarom is het beter voor het observeren van grotere specimenmaterialen.
2. Epi-fluorescentiemicroscoop Dit is een nieuw type fluorescentiemicroscoop dat in de moderne tijd is ontwikkeld. Het verschil is dat het excitatielicht van de objectieflens naar het oppervlak van het monster valt, dat wil zeggen dat dezelfde objectieflens wordt gebruikt als de verlichtingscondensor en de objectieflens voor het verzamelen van fluorescentie. Er moet een dichroïsche bundelsplitser worden toegevoegd in het lichtpad, dat 45 graden verwijderd is van het lichte uranium. Het excitatielicht wordt gereflecteerd in de objectieflens en verzameld op het monster. De fluorescentie die door het monster wordt gegenereerd en het excitatielicht dat wordt gereflecteerd door het lensoppervlak van de objectieflens en het oppervlak van het dekglas gaan tegelijkertijd de objectieflens binnen en keren terug naar de tweekleurige straalsplitser om het excitatielicht gescheiden te maken van fluorescentie , resterend excitatielicht wordt geabsorbeerd door blokkerende filters. Als u overstapt op een combinatie van verschillende excitatiefilters/tweekleurige bundelsplitsers/blokkeringsfilters, kan aan de behoeften van verschillende fluorescentiereactieproducten worden voldaan. Het voordeel van dit soort fluorescentiemicroscopen is dat de verlichting van het gezichtsveld uniform is, de beeldvorming helder is en hoe groter de vergroting, hoe sterker de fluorescentie.
(2) Hoe de fluorescentiemicroscoop te gebruiken.
1. Schakel de lichtbron in, de ultrahogedrukkwiklamp moet een paar minuten opwarmen om het helderste punt te bereiken.
2. Voor de transmissiefluorescentiemicroscoop moet het vereiste excitatiefilter tussen de lichtbron en de condensor worden geïnstalleerd en moet het bijbehorende blokkeerfilter achter de objectieflens worden geïnstalleerd. Epi-fluorescentiemicroscopen moeten het vereiste excitatiefilter/tweekleurige bundelsplitser/blokkeerfilterinzetstukken in de sleuven in het lichtpad steken.
3. Observeer met een lens met een lage vergroting en pas het midden van de lichtbron aan volgens het instelapparaat van verschillende soorten fluorescentiemicroscopen, zodat deze zich in het midden van de gehele verlichtingsvlek bevindt.
4. Plaats het monsterblad en observeer na het scherpstellen. Let op tijdens het gebruik: niet direct observeren met het eindfilter, om geen schade aan de ogen te veroorzaken; bij het observeren van het preparaat met een olielens moet een speciale olielens zonder fluorescentie worden gebruikt; nadat de hogedrukkwiklamp is uitgeschakeld, kan deze niet onmiddellijk weer worden ingeschakeld en moet deze worden getest. Het kan na 5 minuten opnieuw worden gestart, anders is het onstabiel en heeft het invloed op de levensduur van de kwiklamp.
(3) Observatie Met behulp van een blauwvioletlichtfilter onder een fluorescentiemicroscoop op het leerplatform, kan worden gezien dat de cellen gekleurd met o.01 procent acridine-oranje fluorescerende kleurstof, de kern en het cytoplasma worden geëxciteerd om twee verschillende kleuren te produceren fluorescentie (donker)groen en oranjerood).
