Principes van confocale microscopie
Confocale microscoop is een uiterst nauwkeurig beeldvormingsinstrument dat in de jaren tachtig opkwam en zich ontwikkelde, en is een essentieel wetenschappelijk onderzoeksinstrument voor het bestuderen van submicronstructuren. Met de ontwikkeling van computers, beeldverwerkingssoftware en lasers hebben confocale microscopen ook een grote ontwikkeling doorgemaakt en worden ze nu veel gebruikt op het gebied van biologie, microsystemen en materiaalmeting. Confocale microscoop is een nieuw type microscoop dat het confocale principe, scantechnologie en computergraphics-verwerkingstechnologie integreert. De belangrijkste voordelen zijn: hoge laterale resolutie en hoge axiale resolutie, en effectieve onderdrukking van strooilicht, met een hoog contrast.
Een typische opstelling van een confocale microscoop is het plaatsen van twee kleine gaatjes op het geconjugeerde vlak van het brandpuntsvlak van het gemeten object, waarvan er één voor de lichtbron wordt geplaatst en de andere voor de detector, zoals weergegeven in figuur 1. Uit de figuur blijkt dat wanneer het gemeten monster zich in het quasi-focusvlak bevindt, de lichtintensiteit die wordt opgevangen door het detectie-uiteinde het grootst is; wanneer het gemeten monster zich in de onscherpe positie bevindt, verstrooit de lichtvlek aan de detectiezijde en neemt de lichtintensiteit snel af. Daarom kan alleen het licht dat wordt uitgezonden door punten op het brandpuntsvlak door het uitgangsgaatje gaan, terwijl het licht dat wordt uitgezonden door punten buiten het brandpuntsvlak onscherp wordt op het uitgangsgaatje, en de meeste kunnen niet door het centrale gaatje. Daarom lijkt het observatiedoelpunt op het brandpuntsvlak helder en lijkt het niet-observatiepunt zwart als achtergrond, waardoor het contrast toeneemt en het beeld helderder wordt. Tijdens het beeldvormingsproces zijn de twee gaatjes confocaal, het confocale punt is het gedetecteerde punt en het vlak waar het gedetecteerde punt zich bevindt is het confocale vlak.
De grootte van het gaatje bij de detector in confocale microscopie speelt een cruciale rol. Het heeft rechtstreeks invloed op de resolutie en de signaal-ruisverhouding van het systeem. Als de pinhole te groot is, wordt het confocale detectie-effect niet bereikt, wat niet alleen de resolutie van het systeem vermindert, maar ook meer strooilicht introduceert; als het gaatje te klein is, zal dit de detectie-efficiëntie verminderen en het microscopische beeld verminderen. helderheid. Studies hebben aangetoond dat wanneer de diameter van het gaatje gelijk is aan de diameter van de Airy-schijf, aan de confocale vereisten wordt voldaan en de detectie-efficiëntie niet significant wordt verminderd. Aangezien de diameter van het gaatje over het algemeen in de orde van microns ligt, zal er signaalvervorming optreden als er een afwijking is tussen het focuspunt van de laserstraal en de positie van het gaatje. Daarom gebruiken confocale microscopen over het algemeen een autofocussysteem, wat de meettijd virtueel verlengt.
Aangezien de laser confocale scanningmicroscoop een puntbeeldvorming is, is het noodzakelijk om tweedimensionale scanning in de x- en y-richting te gebruiken om een tweedimensionaal beeld van het object te verkrijgen. Verschillende microscopen gebruiken verschillende scanmethoden:
(1) Scannen van objecten. Dat wil zeggen, het object zelf beweegt volgens een bepaalde wet, terwijl de lichtstraal ongewijzigd blijft. Voordelen: stabiel optisch pad; Nadelen: er is een grote scantafel nodig, waardoor de scansnelheid sterk beperkt is.
(2) Een straalscansysteem wordt gevormd door gebruik te maken van een reflecterende galvanometer. Dat wil zeggen, door de scangalvanometer te regelen, wordt de gefocuste lichtvlek regelmatig gereflecteerd naar een bepaalde laag van het object om tweedimensionale scanning te voltooien. Het voordeel is dat het een hoge precisie heeft en vaak wordt gebruikt voor zeer nauwkeurige metingen. De scansnelheid is verbeterd ten opzichte van het scannen van objecten, maar het is nog steeds niet snel.
(3) Gebruik het akoestisch-optische afbuigelement voor scannen en het scannen wordt gerealiseerd door de uitgangsfrequentie van de geluidsgolf te veranderen en vervolgens de transmissierichting van de lichtgolf te veranderen. Het opmerkelijke voordeel is dat de scansnelheid erg hoog is. Het door de Verenigde Staten ontwikkelde scansysteem maakt gebruik van een akoestisch-optische deflector om real-time videobeelden te genereren. Het duurt slechts 1/30s om een tweedimensionaal beeld te scannen en real-time uitvoer wordt bijna bereikt.
(4) Scannen van Nipkow-schijven. Het scanproces wordt voltooid door de Nipkow-schijf te draaien terwijl andere componenten stil blijven staan. Het kan in één keer worden afgebeeld en de snelheid is erg snel. Aangezien de afbeeldingsbundel echter licht buiten de as is, moet de aberratie buiten de as van de lens worden gecorrigeerd en is de benuttingsgraad van lichtenergie zeer laag.
