Principes van fluorescentiemicroscopie
Fluorescentiemicroscopen verschillen van gewone optische microscopen. In plaats van monsters te observeren onder de verlichting van gewone lichtbronnen, gebruiken ze licht van een bepaalde golflengte (meestal ultraviolet licht, blauwviolet licht) om de fluorescerende stoffen in de monsters onder de microscoop te prikkelen, zodat ze fluorescentie uitstralen. Daarom functioneert de lichtbron van een fluorescentiemicroscoop niet als directe verlichting, maar als een energiebron die de fluorescerende stoffen in het preparaat prikkelt. De reden waarom we het monster kunnen observeren, is te wijten aan de verlichting van de lichtbron, maar het fluorescentieverschijnsel dat optreedt nadat de fluorescerende substantie in het monster de geëxciteerde lichtenergie absorbeert.
Het is te zien dat het kenmerk van de fluorescentiemicroscoop is dat de lichtbron een grote hoeveelheid excitatielicht in een specifiek golflengtebereik kan leveren, zodat de fluorescerende stof in het geteste monster het excitatielicht van de noodzakelijke intensiteit kan verkrijgen. Tegelijkertijd moet de fluorescentiemicroscoop het bijbehorende filtersysteem hebben.
Fluorescentiemicroscopie is een essentieel instrument in immunofluorescentie histochemie. Het is samengesteld uit een ultrahoogspanningslichtbron, een filtersysteem (inclusief excitatie- en onderdrukkingsfilterplaat), optisch systeem en fotografiesysteem en andere hoofdcomponenten. Het gebruikt licht van een bepaalde golflengte om het monster te prikkelen om fluorescentie uit te zenden.
De manier om fluorescentie op te wekken: volgens het golflengtebereik van licht kan het in twee typen worden verdeeld: UV-excitatiemethode (met behulp van ultraviolette verlichtingsmethode) en BV-excitatiemethode (met blauw-violet licht). De UV-excitatiemethode gebruikt bijna-ultraviolet licht korter dan 400 nm voor excitatie. Er is geen zichtbaar excitatielicht bij deze methode, dus de waargenomen fluorescentie geeft de inherente fluorescentie van de kleurstof weer en het is gemakkelijk om de specifieke fluorescentie op het monster te onderscheiden van de autofluorescentie van het achtergrondweefsel.
De BV-excitatiemethode is gebaseerd op 404nm en 434nm voor excitatie van ultraviolet naar blauw licht. Deze methode gebruikt blauw licht om het monster te bestralen, dus het afsnijfilter van het fluorescentie-observatiesysteem moet een filter gebruiken dat het blauwe licht volledig kan blokkeren en de vereiste groene en gele fluorescentie volledig kan doorstaan. Fluorescerende kleurstoffen voor testen op fluorescerende antilichamen. De maximale absorptiegolflengte van excitatielicht ligt relatief dicht bij de maximale emissiegolflengte van fluorescentie, dus het filter dat wordt gebruikt in de BV-excitatiemethode moet een scherp afsnijfilter gebruiken. Deze methode kan blauw licht gebruiken als excitatielicht, zodat de absorptie-efficiëntie van het fluorescerende pigment hoger is en een helderder beeld kan worden verkregen. Het nadeel is dat de fluorescentie onder de 500 nm niet zichtbaar is en de fluorescentie boven de 500 nm het hele beeld geel laat lijken. Bij de fluorescerende antilichaammethode wordt de specificiteit van het fluorochroom vaak beoordeeld aan de hand van de kleur die uniek is voor het fluorochroom. Daarom hebben de bovengenoemde tekortkomingen van de BV-excitatiemethode bij het bespreken van subtiele specificiteit vaak een grote invloed.
Samenvattend kan de verlichting van de fluorescentiemicroscoop worden beschouwd volgens de volgende drie punten, afhankelijk van de structuur van de condensor en de golflengte van het excitatielicht.
① Vanuit het perspectief van de contrastvereisten van het fluorescerende beeld, wordt de UV-excitatie donkerveldconcentrator gebruikt voor verlichting.
② Gezien de helderheid van het beeld heeft het BV-excitatiefilter de hoogste observatie-efficiëntie in het donkerveld.
③De kenmerken van UV-excitatiefilter donkerveldobservatie en BV-excitatie donkerveldconcentratorverlichting kunnen worden beschouwd als tussen deze twee verlichtingsmethoden, maar de eerste heeft sterkere donkerveldeigenschappen en geeft helderdere beelden weer. Het contrast is klein; de laatste behoudt de eigenschappen van het donkere veld lichtpad, dus het weergegeven beeld is donkerder en het contrast wordt verbeterd. Wanneer daadwerkelijk een fluorescentiemicroscoop wordt gebruikt, moet voor observatie de verlichtingsmethode worden gebruikt die het beste past bij de vereisten van het monster.
Er moet op worden gewezen dat zelfs als de UV-geëxciteerde donkerveldcondensor met het beste contrast wordt verlicht, een deel van het ultraviolette excitatielicht dat door het monster wordt gebroken of verstrooid, de objectieflens zal binnendringen. Autofluorescentie kan de beeldrespons verergeren. Daarom moet voor het oculair een UV-absorberend filter als afsnijfilter worden gebruikt.
