De grenzen van microscopie met superresolutie verleggen: zelfrichtende microscopie
Ultraprecieze microscopie die verder gaat dan de beperkingen van de Nobelprijswinnende superresolutiemicroscoop zal wetenschappers in staat stellen rechtstreeks de afstanden tussen individuele moleculen te meten.
Medische onderzoekers van de Universiteit van New South Wales hebben een ongekende resolutie bereikt in microscopie met één molecuul om interacties tussen individuele moleculen in intacte cellen te detecteren.
De Nobelprijs voor de Scheikunde 2014 werd toegekend voor de ontwikkeling van fluorescentiemicroscopietechnologie met superresolutie, die microscopisten het eerste moleculaire beeld van de binnenkant van een cel verschafte, een kenmerk dat nieuwe moleculaire beelden van complexe biologische systemen en processen biedt.
Nu zijn de detectielimieten van microscopie met één molecuul opnieuw verlegd en zijn details gepubliceerd in het laatste nummer van Science Advances.
Het is mogelijk geweest om individuele moleculen te observeren en te volgen met microscopen met ultrahoge resolutie, maar de interacties tussen deze moleculen vinden plaats op een schaal die minstens vier keer kleiner is dan die welke wordt opgelost door bestaande microscopen met één molecuul.
“De reden dat microscopen met één molecuul doorgaans een lokalisatienauwkeurigheid van ongeveer 20 tot 30 nanometer hebben, is meestal omdat de microscoop daadwerkelijk beweegt bij het detecteren van signalen. Dit leidt tot onzekerheid. Met behulp van bestaande superresolutie-instrumenten kunnen we er niet in slagen om te bepalen of één eiwit gebonden is aan een ander omdat de afstand tussen hen korter is dan de onzekerheid in hun posities."
Om dit probleem op te lossen, heeft het team een geautomatiseerde feedbacklus in de microscoop met één molecuul gebouwd die het optische pad en het spiegelpodium detecteert en opnieuw uitlijnt.
"Het maakt niet uit wat je met deze microscoop doet, hij vindt in principe het retourpad met nanometerprecisie. Het is een slimme microscoop. Hij kan alles doen wat een operator of servicemonteur moet doen en dat kan twaalf keer per seconde. " Prof. Goss zei.
Het meten van de afstand tussen eiwitten
Met het ontwerp en de methodologie die in dit artikel worden beschreven, heeft het UNSW-team een feedbacksysteem ontworpen dat compatibel is met bestaande microscopen en maximale flexibiliteit biedt voor de monstervoorbereiding.
"Dit is een heel eenvoudige en elegante oplossing voor een groot beeldvormingsprobleem. We hebben zojuist een microscoop in een microscoop gebouwd en het enige wat we deden was de hoofdmicroscoop uitlijnen. De eenvoud en bruikbaarheid van de oplossing die we hebben gevonden, is de echte kracht ervan. Het is gemakkelijk om kloon het systeem en adopteer snel nieuwe technologieën." Prof. Goss zei.
Om het nut van de ultraprecieze feedback-microscoop met één molecuul aan te tonen, gebruikten de onderzoekers deze om directe afstandsmetingen uit te voeren tussen signaaleiwitten in T-cellen. Een algemene aanname in de cellulaire immunologie is dat deze immuuncellen in rust blijven wanneer de T-celreceptor zich dicht bij een ander molecuul bevindt dat als rem werkt.
Hun zeer nauwkeurige microscopie kon aantonen dat de twee signaalmoleculen feitelijk verder van elkaar gescheiden waren in geactiveerde T-cellen, waardoor de rem werd opgeheven en de T-celreceptorsignalering werd ingeschakeld.
Prof. Goss zei: "Conventionele microscopietechnieken zouden zo'n kleine verandering niet nauwkeurig kunnen meten, omdat de afstand tussen deze signaalmoleculen in rustende en geactiveerde T-cellen slechts 4-7 nanometer verschilt."
"Dit laat ook zien hoe gevoelig deze signaalmechanismen zijn voor ruimtelijke isolatie. Om dergelijke regulerende processen te identificeren, moeten we nauwkeurige afstandsmetingen uitvoeren, en dat is wat deze microscoop mogelijk maakt. Deze resultaten illustreren dat de technologie nog volop in ontwikkeling is en op geen enkele manier kan worden vervaardigd." andere manier."
