Kleuringstechnieken en microscopische observatie van micro-organismen
1. Doel
1.1 Leer de basistechnieken van microbiële uitstrijkjes en kleuring.
1.2 Beheers de eenvoudige kleurmethode van bacteriën.
1.3 Een voorlopig inzicht hebben in de morfologische kenmerken van bacteriën en de kennis consolideren over het gebruik van olielenzen en aseptische operatietechnieken.
2 Principes
Het uitsmeren en kleuren van bacteriën is een basistechniek in microbiologische experimenten. Bacteriële cellen zijn klein en transparant, waardoor ze moeilijk te identificeren zijn onder een gewone lichtmicroscoop; ze moeten gekleurd zijn. Voor het verven van bacteriën wordt met één enkele kleurstof gebruikt, waardoor de gekleurde bacteriën een duidelijk kleurverschil vormen met de achtergrond, waardoor hun morfologie en structuur duidelijker waarneembaar zijn. Deze methode is eenvoudig te bedienen en geschikt voor het observeren van de algemene vorm van bacteriecellen en de rangschikking van bacteriën. Basische kleurstoffen worden vaak gebruikt voor eenvoudige kleuring. Dit komt omdat bacteriële cellen in neutrale, alkalische of zwak zure oplossingen meestal negatief geladen zijn, en wanneer basische kleurstoffen worden geïoniseerd, is het vervende deel van hun moleculen positief geladen, dus ze zijn alkalisch. Het kleurende deel van de kleurstof combineert gemakkelijk met bacteriën om ze te kleuren. De gekleurde bacteriecellen contrasteren scherp met de achtergrond, waardoor ze onder een microscoop gemakkelijker te identificeren zijn. Kleurstoffen die vaak worden gebruikt voor eenvoudig verven zijn onder meer methyleenblauw, kristalviolet, basische fuchsine, enz. Wanneer bacteriën suikers afbreken en zuur produceren, waardoor de pH van het kweekmedium daalt, neemt de positieve lading van de bacteriën toe. Op dit moment kunnen zure kleurstoffen zoals eosine, zure fuchsine of Congorood worden gebruikt voor kleuring. Bacteriën moeten vóór het kleuren worden gefixeerd. Het heeft twee doelen: het ene is om bacteriën te doden en ze aan het glasplaatje te laten hechten; de andere is om hun affiniteit voor kleurstoffen te vergroten. Twee veelgebruikte methoden zijn verwarming en chemische fixatie. Probeer bij het repareren de oorspronkelijke vorm van de cellen te behouden.
3 materialen
3.1 Bacteriën: Bacillus subtilis 12-18h voedingsagar schuine cultuur, Staphylococcus aureus 24 uur voedingsagar schuine cultuur, Escherichia coli 24 uur voedingsagar schuine cultuur, bakkersgistagar schuine cultuur.
3.2 Kleurstof: Lu's alkalische methyleenblauwe kleurstof (of ammoniumoxalaat kristalviolet kleurstof), carbolzuurfuchsinekleurstof.
3.3 Instrumenten of ander keukengerei: microscoop, alcohollamp, objectglaasje, inentingslus, rek voor objectglaasjes, dubbellaagse fles (met cederolie en xyleen), lensweefsel, fysiologische zoutoplossing of gedestilleerd water, enz.
4. Proces: uitstrijken → drogen → fixeren → kleuren → wassen → drogen → microscopisch onderzoek.
5 stappen
5.1 Uitstrijkje: Neem twee schone en olievrije objectglaasjes. Plaats onder steriele omstandigheden een kleine druppel normale zoutoplossing (of gedestilleerd water) op elk midden van het glasplaatje. Gebruik een inentingslus om de bacteriën van Bacillus subtilis te steriliseren. , Micrococcus luteus en Escherichia coli, pluk een beetje bacteriegras in de waterdruppels op de schuine kant, meng goed en breng het aan in een dunne film. Als u een uitstrijkje met bacteriële suspensie (of vloeibare cultuur) gebruikt, kunt u met een entlus 2 tot 3 lussen uitkiezen en deze direct op het objectglaasje aanbrengen. Zorg ervoor dat u niet te veel fysiologische zoutoplossing (gedestilleerd water) laat vallen, verwijder bacteriën en breng het gelijkmatig en niet te dik aan.
5.2 Drogen Natuurlijk drogen bij kamertemperatuur. Je kunt het ook iets verwarmen boven een alcohollamp met de gecoate kant naar boven om het te drogen. Maar zorg ervoor dat je niet te dicht bij de vlam komt, omdat een te hoge temperatuur de morfologie van de bacteriën zal vernietigen.
5.3 Fixatie Bij gebruik van verwarmd drogen worden fixatie en droging gecombineerd in één stap en is de werkwijze hetzelfde als drogen. Uitsmeren, drogen en hittefixeren.
5.4 Kleuring: Plaats het objectglaasje plat op het rek voor objectglaasjes en voeg 1 tot 2 druppels kleurstofoplossing toe aan het uitstrijkje (het is passend dat de kleurstofoplossing de uitstrijkfilm net bedekt). Vlek met Lu's basische methyleenblauw gedurende 1 tot 2 minuten en kleur met carbolzuurfuchsine (of ammoniumoxalaatkristalviolet) gedurende ongeveer 1 minuut.
5.5 Wassen met water: Giet de kleurstofoplossing af en spoel voorzichtig met kraanwater vanaf het ene uiteinde van de glijbaan totdat het water dat uit het uitstrijkje naar beneden loopt kleurloos is. Bij het wassen met water mag u het gecoate oppervlak niet rechtstreeks met water wassen. De waterstroom mag niet te snel of te groot zijn om te voorkomen dat de smeerfilm eraf valt.
5.6 Drogen: Schud de waterdruppels op de glijbaan af en droog op natuurlijke wijze, föhn het droog met een föhn of absorbeer het met absorberend papier (pas op dat u de bacteriën niet wegveegt). 5.7 Microscopisch onderzoek Nadat het uitstrijkje droog is, voert u microscopisch onderzoek uit. Het uitstrijkje moet volledig droog zijn voordat u het met een olielens kunt bekijken.
6 Resultaten Teken de morfologie van E. coli en Micrococcus luteus waargenomen na enkele kleuring.
