Technische kenmerken en gebruiksvaardigheden van twee-foton fluorescentiemicroscoop
Twee-foton fluorescentiemicroscopie is een nieuwe technologie die laser scanning confocale microscopie en twee-foton excitatietechnologie combineert.
Het basisprincipe van excitatie met twee fotonen is: in het geval van een hoge fotonendichtheid kunnen fluorescerende moleculen twee fotonen met een lange golflengte tegelijkertijd absorberen en een foton met een kortere golflengte uitzenden na een korte periode van de zogenaamde aangeslagen toestand. . ; Het effect is hetzelfde als het gebruik van een foton met een golflengte die de helft van de lange golflengte is om een fluorescerend molecuul te exciteren. Excitatie met twee fotonen vereist een hoge fotonendichtheid. Om cellen niet te beschadigen, maakt twee-fotonenmicroscopie gebruik van high-energy mode-locked pulsed lasers. De laser die door deze laser wordt uitgezonden, heeft een hoge piekenergie en een lage gemiddelde energie, de pulsbreedte is slechts 100 femtoseconden en de periode kan 80 tot 100 megahertz bereiken. Wanneer een objectieflens met een hoge numerieke apertuur wordt gebruikt om de fotonen van de gepulseerde laser te focussen, is de fotonendichtheid in het brandpunt van de objectieflens het hoogst en treedt de excitatie van twee fotonen alleen op in het brandpunt van de objectieflens, dus de twee-fotonenmicroscoop heeft geen confocaal gaatje nodig, wat de fluorescentiedetectie-efficiëntie verbetert. Het is een belangrijke onderzoeksmethode op het gebied van morfologie, moleculaire celbiologie, neurowetenschappen en farmacologie.
1. De achtergrond van de opkomst van twee-fotonenmicroscopie - twee beperkingen van traditionele laserconfocale microscopie:
1) Een daarvan is het fenomeen van fototoxiciteit: omdat het confocale gaatje klein genoeg moet zijn om een beeld met hoge resolutie te verkrijgen, en het kleine diafragma een groot deel van de door het monster uitgestraalde fluorescentie zal blokkeren, inclusief de fluorescentie die door het brandpuntsvlak wordt uitgestraald, het overeenkomstige Ja, het excitatielicht moet sterk genoeg zijn om een voldoende signaal-ruisverhouding te verkrijgen; en de laser met hoge intensiteit zorgt ervoor dat de fluorescerende kleurstof snel vervaagt tijdens continu scannen, en het fluorescerende signaal zal zwakker en zwakker worden naarmate het scannen vordert.
2) Fototoxiciteit is een ander probleem. Onder laserbestraling zullen veel fluorescerende kleurstofmoleculen cytotoxinen produceren, zoals singlet-zuurstof of vrije radicalen, dus de scantijd en de optische vermogensdichtheid van het excitatielicht moeten in het experiment worden beperkt om de monsterdichtheid te behouden. actief. In het onderzoek naar actieve monsters maken vooral de verschillende stadia van de groei en ontwikkeling van actieve monsters, fotobleken en fototoxiciteit deze studies zeer beperkt.
2. Waarom zegt u dat twee-fotonenmicroscopen over het algemeen niet hoeven te worden uitgerust met ultraviolette excitatielasers?
Twee-fotonenmicroscopie is een fluorescentie-excitatietechnologie gebaseerd op het twee-foton-excitatie-effect: fluorescerende kleurstofmoleculen kunnen worden geëxciteerd door twee laagenergetische fotonen tegelijkertijd te absorberen (het tijdsinterval tussen twee fotonen die fluorescerende moleculen bereiken is minder dan 1 femtoseconde ), kan het excitatie-effect gelijk zijn aan het absorberen van een hoogenergetisch foton met een halve golflengte. Het absorberen van twee fotonen op rode golflengten is bijvoorbeeld equivalent aan een molecuul dat ultraviolet absorbeert. Fotonen met een lange golflengte worden niet gemakkelijk door cellen geabsorbeerd, dus de fototoxiciteit voor levende cellen wordt verminderd en ook het fotobleken wordt verminderd. Op deze manier speelt het niet alleen de functie van ultraviolette excitatie, maar voorkomt het ook de schade van ultraviolet licht aan het monster.
3. Wat is er speciaal aan de laser van een microscoop met twee fotonen?
De kans op absorptie van twee fotonen hangt af van hoe dicht de twee invallende fotonen in ruimte en tijd samenvallen (de twee fotonen moeten binnen 10-18 seconden aankomen). De dwarsdoorsnede van twee fotonenabsorptie is klein en alleen fluoroforen in gebieden met een grote fotonflux worden geëxciteerd. Daarom zijn de meeste gebruikte lasers titanium-saffierlasers, die scansnelheden van picoseconde of femtoseconde kunnen bereiken, en een zeer hoog piekvermogen en een laag gemiddeld vermogen hebben, zodat fotobleken en fototoxiciteit kunnen worden verminderd of geëlimineerd. Het belangrijkste is om een zeer hoge dichtheid van fotonen in een klein bereik te bieden, wat de gelijktijdige excitatie van twee fotonen kan garanderen.
4. Wat zijn de voordelen van excitatie met twee fotonen?
1) Verhoog de selectiviteit van de kleurstof: het excitatielichtbereik van de confocale systeemlaser (Ar, Ar/Kr, HeNe) is 488nm - 647nm. Dit betekent experimenteren met UV-geëxciteerde fluorescerende kleurstoffen, bijvoorbeeld met DAPI, Hoescht. De excitatiegolflengte van twee fotonen is tweemaal die van een enkel foton, dus kleurstoffen die worden geëxciteerd door ultraviolet kunnen worden geëxciteerd door nabij-infrarood licht.
2) Verminder fotobleken: vanwege de vermindering van fotobleken neemt het slagingspercentage van experimenten met CFP/YFP voor fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) toe.
3) Er is geen speciale objectieflens vereist: vanuit hardwareoogpunt vereist de excitatie van UV-geëxciteerde kleurstoffen met de golflengte van nabij-infraroodlicht geen speciale UV-optische componenten.
4) Verbeter de signaal-ruisverhouding: de golflengte van het excitatielicht en de uitgezonden lichtgolflengte hebben een groot verschil, wat de signaal-ruisverhouding verbetert.
5) Bleken gelokaliseerd in het brandpunt: aangezien fluorescentie-excitatie alleen plaatsvindt in het brandpunt van het objectief, is een confocaal gaatje niet nodig. Dit verbetert de lichtdetectie en fotobleken vindt alleen plaats in het brandpunt.
6) Gemakkelijker om monsters te penetreren: Infrarood golflengtelicht wordt niet gemakkelijk verstrooid door cellen en kan diepere monsters binnendringen.
5. Wat is de grootste verbetering van twee-fotonenmicroscopie, vergeleken met confocale microscopie met laserscanning?
1) Minder fotobleken.
2) Verminderde fototoxiciteit.
3) Het is niet gemakkelijk te verspreiden en het is gemakkelijker om dikke monsters, zoals hersenschijfjes, te penetreren.
