De belangrijkste observatiemethode van optische microscoop is fluorescentiewaarneming
Fluorescentie fenomeen
Fluorescentie verwijst naar het proces waarbij een fluorescerende stof bijna gelijktijdig licht met een langere golflengte uitzendt wanneer het wordt bestraald met licht van een specifieke golflengte (figuur 1). Wanneer licht met een specifieke golflengte (excitatiegolflengte) een molecuul treft (zoals een molecuul in een fluorofoor), wordt de fotonenergie geabsorbeerd door de elektronen van het molecuul. Vervolgens gaan de elektronen over van de grondtoestand (S0) naar een hoger energieniveau, de aangeslagen toestand (S1'). Dit proces wordt excitatie① genoemd. Het elektron blijft 10-9–10-8 seconden in de aangeslagen toestand, waarin het elektron wat energie verliest ②. Tijdens het verlaten van de aangeslagen toestand (S1) en het terugkeren naar de grondtoestand ③, zal de resterende energie die tijdens het excitatieproces is geabsorbeerd, worden vrijgegeven.
De verblijftijd van een fluorescerend molecuul in de aangeslagen toestand is de levensduur van de fluorescentie, doorgaans in nanoseconden, wat een inherent kenmerk is van het fluorescerende molecuul zelf. De technologie van beeldvorming met behulp van fluorescentielevensduur wordt Fluorescentie Lifetime Imaging (FLIM) genoemd, die naast fluorescentie-intensiteitsbeeldvorming meer diepgaande functionele en nauwkeurige metingen kan uitvoeren om moleculaire conformatie, intermoleculaire interacties en moleculaire micro-omgevingen te verkrijgen. informatie die moeilijk te verkrijgen is met conventionele optische beeldvorming.
Een andere belangrijke eigenschap van fluorescentie is de Stokes-verschuiving, het verschil in golflengte tussen de excitatie- en emissiepieken (Figuur 2). Gewoonlijk is de golflengte van het emissielicht langer dan de golflengte van het excitatielicht. Dit komt omdat nadat de fluorescerende stof is aangeslagen en voordat het foton wordt vrijgegeven, de elektronen een deel van de energie zullen verliezen door het relaxatieproces. Fluorescerende stoffen met grotere Stokes-verschuivingen zijn gemakkelijker waar te nemen onder een fluorescentiemicroscoop.
Fluorescentiemicroscopen en fluorescentiefilterblokken
Fluorescentiemicroscopie is een optische microscoop die fluorescentie-eigenschappen gebruikt om te observeren en af te beelden, en wordt veel gebruikt in celbiologie, neurobiologie, plantkunde, microbiologie, pathologie, genetica en andere gebieden. Fluorescentiebeeldvorming heeft de voordelen van hoge gevoeligheid en hoge specificiteit, en is zeer geschikt voor de observatie van de verdeling van specifieke eiwitten, organellen, enz. in weefsels en cellen, de studie van co-lokalisatie en interactie, en het volgen van levensdynamiek processen zoals veranderingen in ionenconcentratie.
De meeste moleculen in cellen fluoresceren niet, en om ze te kunnen zien, moeten ze fluorescerend gelabeld zijn. Er zijn veel methoden voor fluorescerende labeling, die direct kunnen worden gelabeld (zoals het gebruik van DAPI om DNA te labelen), of immunokleuring met behulp van de antigeenbindende eigenschappen van antilichamen, of het doeleiwit kan worden gelabeld met fluorescerende eiwitten (zoals GFP, groen fluorescerend eiwit), of omkeerbare binding. synthetische kleurstoffen (zoals Fura-2), enz.
Op dit moment is de fluorescentiemicroscoop de standaard beeldvormingsapparatuur geworden van verschillende laboratoria en beeldvormingsplatforms, en het is een goede hulp voor onze dagelijkse experimenten. Fluorescentiemicroscopen zijn grofweg in te delen in drie categorieën: rechtopstaande fluorescentiemicroscopen (geschikt voor secties), omgekeerde fluorescentiemicroscopen (geschikt voor levende cellen, rekening houdend met secties), fluorescentie stereoscopische microscopen (geschikt voor grotere exemplaren, zoals planten, zebravissen (volwassen/ embryo), medaka, organen van muizen/ratten, enz.).
Het fluorescentiefilterblok is de kerncomponent van fluorescentiebeeldvorming in microscopen. Het bestaat uit een excitatiefilter, een emissiefilter en een dichroïsche bundelsplitser. Het wordt geïnstalleerd in het filterwiel, zoals de Leica DMi8 die is uitgerust met een 6-positiefilterwiel (Afbeelding 3). ). Verschillende microscopen hebben verschillende wielposities en sommige microscopen gebruiken filterglaasjes.
Het filterblok speelt een belangrijke rol bij fluorescentiebeeldvorming: het excitatiefilter selecteert het excitatielicht om het monster te exciteren en blokkeert andere golflengten van licht; het licht dat door het excitatiefilter gaat, gaat door een dichroïsche bundelsplitser (zijn rol is om het excitatielicht te reflecteren en de fluorescentie door te geven), na reflectie wordt het gefocusseerd door de objectieflens, bestraald naar het monster en de overeenkomstige fluorescentie wordt geëxciteerd naar licht uitstralen. Het uitgezonden licht wordt opgevangen door de objectieflens, gaat door de dichroïsche bundelsplitser en bereikt het emissiefilter. Zoals weergegeven in afbeelding 4: de excitatiegolflengte is 450-490nm, de dichroïsche bundelsplitser reflecteert licht korter dan 510 nm, zendt licht uit dat langer is dan 510 nm en het ontvangstbereik voor emissielicht is 520-560nm.
Fluorescentiefilters die gewoonlijk worden gebruikt in fluorescentiemicroscopen kunnen worden onderverdeeld in twee typen: long pass (afgekort LP) en band pass (afgekort BP). De banddoorlaat wordt meestal bepaald door de centrale golflengte en de breedte van het interval, bijvoorbeeld 480/40, wat betekent dat licht van 460-500nm kan worden doorgelaten. Longpass-filters, zoals 515 LP, laten licht door met een golflengte langer dan 515 nm (Afbeelding 5).
Fluorescerende stoffen hebben hun karakteristieke excitatie- (absorptie) curve en emissiecurve, de excitatiepiek is de ideale excitatiegolflengte (hoge excitatie-efficiëntie, die de excitatielichtenergie kan verminderen, cellen en kleurstoffen kan beschermen), en de emissiecurve is de emissie-fluorescentiegolflengte bereik. Daarom zullen we in het experiment de golflengte kiezen die zo dicht mogelijk bij de excitatiepiek ligt voor excitatie, en het ontvangstbereik moet de emissiepiek omvatten. De excitatiepiek van Alexa Fluor 488 is bijvoorbeeld 500 nm en het excitatiefilter van 480/40 kan worden geselecteerd in de fluorescentiemicroscoop.
Details van de filterkubussen kunnen worden bekeken in de microscoopbeeldvormingssoftware. Het begrijpen van kleurstoffen en het vinden van het filter dat het beste bij uw monster past, is van cruciaal belang voor fluorescentiebeeldvorming. De spectrale informatie van fluorescerende kleurstoffen en fluorescerende eiwitten wordt over het algemeen aangegeven in de instructies en is ook online te vinden.
Naast de excitatie- en emissiegolflengten van fluorescerende sondes, moet bij de selectie van filterblokken ook worden overwogen of er niet-specifieke excitatie is en of er kruiskleur is voor meerkleuren gelabelde monsters. Bovendien moet rekening worden gehouden met de gebruikte fluorescerende lichtbron. Momenteel zijn de veelgebruikte fluorescentielichtbronnen kwiklampen, metaalhalidelampen en LED-lichtbronnen die zich de afgelopen jaren snel hebben ontwikkeld. Het spectrum van een fluorescerende lichtbron is continu of discontinu en de energie zal verschillen in verschillende golflengtebanden. LED-lichtbron wordt geleidelijk de belangrijkste lichtbron van fluorescentiemicroscoop vanwege de relatief smalle spectrale band, stabielere energie-output, lange levensduur, veiliger en milieubescherming en vele andere voordelen.
Naast het ingebouwde filterblok van de microscoop is er ook een extern snelwiel (Figuur 7). De conversiesnelheid van het filter naast het externe snelle wiel van Leica is 27 ms, wat snelle meerkleurenexperimenten kan realiseren, zoals FRET en Fura2-ratio calciumbeeldvorming. (Fig. 8) et al.
Een grote verscheidenheid aan beeldvormingstechnieken met fluorescentiemicroscopie
Om te voldoen aan verschillende behoeften op het gebied van fluorescentiebeeldvorming, zijn er naast fluorescentiemicroscopen verschillende beeldvormingsoplossingen voor fluorescentiemicroscopie ontwikkeld:
Wide-field high-definition beeldvormingssystemen, zoals Leica THUNDER Imager, gebruiken Leica's innovatieve Clearing-technologie om niet-brandpuntsvlakinterferentiesignalen efficiënt te verwijderen tijdens beeldvorming, waardoor heldere beelden en de voordelen van beeldvorming met hoge snelheid worden gepresenteerd;
De confocale laserscanningmicroscoop maakt gebruik van gaatjes om niet-brandvlakinterferentie te elimineren, realiseert optische secties en verkrijgt high-definition beelden en driedimensionale beelden;
Microscopen met ultrahoge resolutie en nanomicroscopen die de diffractielimiet doorbreken, kunnen fijne structuren waarnemen die kleiner zijn dan 200 nm;
Een multifoton-beeldvormingssysteem dat gebruikmaakt van het principe van multifoton-excitatie voor beeldvorming van dik weefsel en diep in vivo;
Light sheet imaging-technologie met hoge temporele en ruimtelijke resolutie, hoge beeldsnelheid, hoge resolutie, lage fototoxiciteit, vooral geschikt voor onderzoek naar ontwikkeling en in vivo dynamische observatie;
Fluorescentie-levensduurbeeldvorming (FLIM), die niet wordt beïnvloed door factoren zoals concentratie van fluorescerende stoffen, fotobleken, excitatielichtintensiteit, enz., kan meer diepgaande functionele en nauwkeurige metingen uitvoeren;
Fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) en fluorescentiekruiscorrelatiespectroscopie (FCCS), meet het moleculaire aantal en de diffusiecoëfficiënt van fluorescerende moleculen, waarbij moleculaire concentratie, moleculaire grootte, viscositeit, moleculaire beweging, moleculaire binding/dissociatie en moleculaire optische eigenschappen worden geanalyseerd;
Totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRF), met extreem hoge z-as resolutie, is ideaal voor het bestuderen van de moleculaire structuur en dynamiek van celmembraanoppervlakken.
