Er zijn twee soorten fluorescentiemicroscopen wat betreft hun optische paden:
1. Transmissiefluorescentiemicroscoop: De excitatielichtbron wordt gebruikt om fluorescentie op te wekken door door het monstermateriaal te gaan via een condensorlens. Er kunnen ook algemeen gebruikte donkerveldconcentrators worden gebruikt, en gewone concentrators kunnen worden gebruikt om de reflector zo aan te passen dat het excitatielicht naar het monster wordt gericht en zijlobsgewijs wordt gericht. Dit is een relatief ouderwetse fluorescentiemicroscoop. Het voordeel is de sterke fluorescentie bij lage vergroting, maar het nadeel is dat de fluorescentie afneemt bij toenemende vergroting. Daarom is het beter voor het observeren van grotere monstermaterialen.
2. Vallende lichtfluorescentiemicroscoop is een nieuw type fluorescentiemicroscoop dat in de moderne tijd is ontwikkeld. In tegenstelling tot het bovenstaande valt het excitatielicht van de objectieflens naar beneden op het oppervlak van het monster, waarbij dezelfde objectieflens wordt gebruikt als de verlichtingscondensator en de objectieflens voor het verzamelen van fluorescentie. Er moet een tweekleurige bundelsplitser worden toegevoegd aan het optische pad, dat 45 graden verwijderd is van het lichte uranium. Hoek: het excitatielicht wordt gereflecteerd in de objectieflens en gefocust op het monster. De door het monster gegenereerde fluorescentie, evenals het excitatielicht dat wordt gereflecteerd door het oppervlak van de objectieflens en het dekglas, komen de objectieflens binnen en keren terug naar de tweekleurige bundelsplitser, waardoor het excitatielicht en de fluorescentie worden gescheiden. Het resterende excitatielicht wordt vervolgens geabsorbeerd door het blokkeerfilter. Als er verschillende combinaties van excitatiefilters/dubbele kleurenbundelscheiders/blokkeerfilters worden gebruikt, kunnen deze voldoen aan de behoeften van verschillende fluorescerende reactieproducten. De voordelen van deze fluorescentiemicroscoop zijn uniforme veldverlichting, heldere beeldvorming en sterkere fluorescentie bij grotere vergroting.
