Wat is het doel van een confocale microscoop?
1. Na de inspanningen en verbeteringen van onze grote voorgangers heeft de optische microscoop het punt van perfectie bereikt. In feite kunnen gewone microscopen ons eenvoudig en snel prachtige microscopische beelden opleveren. Er gebeurde echter een gebeurtenis die revolutionaire innovatie bracht in deze bijna perfecte microscoopwereld, namelijk de uitvinding van de "laser scanning confocal microscope". Het kenmerk van dit nieuwe type microscoop is dat het een optisch systeem gebruikt dat alleen beeldinformatie extraheert op het oppervlak waarop de focus is geconcentreerd, en de verkregen informatie in het beeldgeheugen herstelt terwijl de focus wordt gewijzigd, zodat volledige 3D-informatie kan worden weergegeven. verkregen. Een sterk beeld van intelligentie. Met deze methode is het mogelijk om gemakkelijk informatie te verkrijgen over de oppervlaktevorm die niet kan worden bevestigd met een normale microscoop. Bovendien zijn voor gewone optische microscopen "toenemende resolutie" en "verdiepende scherptediepte" tegenstrijdige omstandigheden, vooral bij sterke vergrotingen, deze tegenstelling is prominenter aanwezig, maar in termen van confocale microscopen is dit probleem gemakkelijk op te lossen.
2. Voordelen van confocaal optisch systeem
Schematisch diagram van laser confocale microscoop
Het confocale optische systeem voert puntverlichting uit op het monster en het gereflecteerde licht wordt ook opgevangen door de puntreceptor. Wanneer het monster in de focuspositie wordt geplaatst, kan bijna al het gereflecteerde licht de fotoreceptor bereiken en wanneer het monster onscherp is, kan het gereflecteerde licht de fotoreceptor niet bereiken. Dat wil zeggen, in het confocale optische systeem zal alleen het beeld worden uitgevoerd dat samenvalt met het brandpunt, en de lichtvlekken en het nutteloze verstrooide licht zullen worden afgeschermd.
3. Waarom laser gebruiken?
In het confocale optische systeem wordt het monster op een punt verlicht en wordt het gereflecteerde licht ook opgevangen door een puntfotoreceptor. Daarom is een puntlichtbron noodzakelijk. Lasers zijn zeer puntlichtbronnen. In de meeste gevallen worden laserlichtbronnen gebruikt als lichtbronnen voor confocale microscopen. Bovendien zijn de kenmerken van monochromaticiteit, directionaliteit en uitstekende straalvorm van laser ook belangrijke redenen voor de brede acceptatie ervan.
4. Realtime observatie op basis van high-speed scanning wordt mogelijk
Voor laserscanning wordt de akoestisch geactiveerde optische deflectie-eenheid (Acoustic Optical Deflector, AO-element) in horizontale richting gebruikt en wordt de Servo Galvano-spiegel in verticale richting gebruikt. Aangezien de akoestisch-optische deflectie-eenheid geen mechanisch trillingsgedeelte heeft, kan het scannen met hoge snelheid uitvoeren en is real-time observatie op het beeldscherm mogelijk. Deze snelle beeldvorming is een zeer belangrijk item dat rechtstreeks van invloed is op de snelheid van scherpstellen en het ophalen van posities.
5. De relatie tussen focuspositie en helderheid
In het confocale optische systeem is de helderheid van het monster het maximum wanneer het monster correct in de brandpuntspositie is geplaatst, en de helderheid zal ervoor en erna scherp afnemen (de ononderbroken lijn in figuur 4). De gevoelige selectiviteit van het brandpuntsvlak is ook het principe van confocale microscoophoogterichtingbepaling en brandpuntsdiepte-uitbreiding. Daarentegen hebben gewone optische microscopen geen significante helderheidsveranderingen voor en na de focuspositie.
6. Hoog contrast, hoge resolutie
In gewone optische microscopen overlapt het door de interferentie van het gereflecteerde licht van het focusgedeelte met het focusafbeeldingsgedeelte, wat resulteert in een afname van het beeldcontrast. Aan de andere kant wordt in het confocale optische systeem het verstrooide licht buiten het brandpunt en het verstrooide licht binnen de objectieflens bijna volledig verwijderd, zodat een beeld met een zeer hoog contrast kan worden verkregen. Bovendien, omdat het licht twee keer door de objectieflens gaat, wordt eerst het puntbeeld verscherpt, wat ook het oplossend vermogen van de microscoop ten goede komt.
7. Optische lokalisatiefunctie
In het confocale optische systeem wordt het gereflecteerde licht anders dan het punt dat samenvalt met het brandpunt afgeschermd door de microporie. Daarom wordt bij het observeren van een driedimensionaal monster een beeld gevormd alsof het monster is doorgesneden met het brandpuntsvlak (figuur 5). Dit effect staat bekend als optische lokalisatie en is een van de specialiteiten van confocale optische systemen.
8. Focus mobiele geheugenfunctie
Het zogenaamde gereflecteerde licht buiten het brandpunt wordt afgeschermd door de microporiën. Aan de andere kant kan worden aangenomen dat alle punten op het beeld gevormd door het confocale optische systeem samenvallen met het brandpunt. Daarom, als het driedimensionale monster langs de Z-as (optische as) wordt verplaatst, worden de beelden geaccumuleerd en opgeslagen in het geheugen, en uiteindelijk wordt het beeld gevormd door het hele monster en het brandpunt verkregen. De functie van het op deze manier oneindig verdiepen van de scherptediepte wordt de functie van mobiel geheugen genoemd.
9. Meetfunctie voor oppervlaktevorm
In termen van focusverschuivingsfunctie kan de oppervlaktevorm van het monster contactloos worden gemeten door een opnamecircuit voor de oppervlaktehoogte toe te voegen. Op basis van deze functie is het mogelijk om de Z-ascoördinaten vast te leggen die worden gevormd door de maximale luminantiewaarde in elke pixel, en op basis van deze informatie kan informatie met betrekking tot de vorm van het monsteroppervlak worden verkregen.
10. Uiterst nauwkeurige micro-meetfunctie
De lichtontvangende eenheid maakt gebruik van een 1-dimensionale CCD-beeldsensor, zodat deze niet wordt beïnvloed door de scankanteling van het scanapparaat, zodat uiterst nauwkeurige metingen kunnen worden voltooid. Bovendien kan door het gebruik van de focus shift-geheugenfunctie met instelbare focusdiepte (deepening) de meetfout veroorzaakt door focus shift worden geëlimineerd.
11. Driedimensionale beeldanalyse
Met behulp van de functie voor het meten van de oppervlaktevorm kunt u eenvoudig een driedimensionaal beeld van het monsteroppervlak maken. Niet alleen dat, maar kan ook een verscheidenheid aan analyses uitvoeren, zoals: oppervlakteruwheidsmeting, oppervlakte, volume, oppervlakte, rondheid, straal, maximale lengte, omtrek, zwaartepunt, tomografisch beeld, FFT-transformatie, lijnbreedtemeting, enz. .
Laser confocale scanningmicroscoop kan niet alleen worden gebruikt voor het observeren van celmorfologie, maar ook voor kwantitatieve analyse van intracellulaire biochemische componenten, optische dichtheidsstatistieken en meting van celmorfologie.
