Wat is twee-foton fluorescentiemicroscopie
Het basisprincipe van excitatie met twee fotonen is: in het geval van een hoge fotonendichtheid kunnen fluorescerende moleculen twee fotonen met een lange golflengte tegelijkertijd absorberen en een foton met een kortere golflengte uitzenden na een korte periode van de zogenaamde aangeslagen toestand. . ; het effect is hetzelfde als het gebruik van een foton waarvan de golflengte de helft van de lange golflengte is om een fluorescerend molecuul op te wekken. Excitatie met twee fotonen vereist een hoge fotonendichtheid. Om cellen niet te beschadigen, maakt twee-fotonenmicroscopie gebruik van high-energy mode-locked pulsed lasers. De laser die door deze laser wordt uitgezonden, heeft een hoge piekenergie en een lage gemiddelde energie, de pulsbreedte is slechts 100 femtoseconden en de frequentie kan 80 tot 100 megahertz bereiken. Wanneer een objectieflens met een hoge numerieke apertuur wordt gebruikt om de fotonen van de gepulseerde laser te focussen, is de fotonendichtheid in het brandpunt van de objectieflens het hoogst en treedt de excitatie van twee fotonen alleen op in het brandpunt van de objectieflens, dus de twee-fotonenmicroscoop heeft geen confocaal gaatje nodig, wat de fluorescentiedetectie-efficiëntie verbetert.
In algemene fluorescentieverschijnselen kan een fluorescerend molecuul vanwege de lage fotonendichtheid van het excitatielicht slechts één foton tegelijkertijd absorberen en vervolgens een fluorescerend foton uitzenden via een stralingsovergang, wat fluorescentie met één foton is. Voor het fluorescentie-excitatieproces waarbij laser als lichtbron wordt gebruikt, kan fluorescentie met twee fotonen of zelfs met meerdere fotonen optreden. Op dit moment is de intensiteit van de gebruikte excitatielichtbron hoog en voldoet de fotonendichtheid aan de vereisten van fluorescerende moleculen die tegelijkertijd twee fotonen absorberen. Bij het gebruik van een algemene laser als excitatielichtbron is de fotonendichtheid nog steeds niet voldoende om het verschijnsel van twee fotonenabsorptie te produceren. Gewoonlijk wordt een femtoseconde gepulseerde laser gebruikt en het momentane vermogen kan de orde van megawatt bereiken. Daarom is de golflengte van fluorescentie met twee fotonen korter dan de golflengte van excitatielicht, wat overeenkomt met het effect dat wordt geproduceerd door excitatie bij de helft van de excitatiegolflengte.
