Kenmerken en toepassingen van confocale lasermicroscopie
Laser scanning confocal microscope (LSCM) is een type microscoop dat is ontworpen op basis van geconjugeerde focustechnologie, dat wil zeggen om de laserlichtbron, het te testen monster en de detector allemaal in de geconjugeerde positie van elkaar te plaatsen.
Fundamenteel
In algemene microscopen valt het brandpuntsvlak van de objectieflens samen met de detector, zodat het waargenomen beeldvlak geïsoleerd is van het aangrenzende axiale vlak, terwijl in confocale microscopen het monster wordt belicht door een diffractiebeperkte lichtvlek te gebruiken, en in de Dit isolatie-effect wordt bereikt door gebruik te maken van een gaatje in het verzamellichtpad in het brandpunt van de spot, geconjugeerd om strooilicht te filteren om de resolutie te verbeteren.
Beeldvormingsfuncties
Alleen het licht dat wordt teruggekaatst door de geconjugeerde monsterlaag kan door het kleine gaatje in het lichtpad van de verzameling gaan, en de resterende irrelevante reflecties van de monsterlaag worden geblokkeerd door het kleine gaatje. Dit kan resulteren in een aanzienlijke verhoging van de resolutie. Hieronder wordt een zij-aan-zij vergelijking getoond van multidimensionale fluorescentiemicroscopie en confocale microscopie van hetzelfde dikke monster. Wanneer een reeks afbeeldingen wordt gemaakt op verschillende brandpuntsvlakken, kan een zogenaamde "z-stack" worden gegenereerd, en deze afbeelding toont zowel de resolutie- als contrastwinsten die worden geboden door confocale microscopie en de onderliggende oorzaken van deze winsten. Het onderzoeken van het beeld bovenaan de stapel met het beeldvlak boven het weefsel onthult veel verstrooid licht in het fluorescentiebeeld, terwijl het confocale beeld zwart lijkt. Deze reductie in PSF in axiale richting is direct verantwoordelijk voor het verschil in resolutie dat wordt waargenomen bij de optische interface in het midden van de z-stack.
Een ander kenmerk van confocale microscopie met laserscanning is dat het een scantechnologie is. De traditionele breedveldverlichtingstechnologie verlicht het hele monster, zodat het beeld direct kan worden vastgelegd met het blote oog of een detector, maar LSCM gebruikt een straal of meerdere gefocusseerde stralen gaan door het monster voor scannen en beeldvorming, en het resulterende beeld is een optische sectie genoemd. Het volgende toont het verschil tussen de traditionele breedveldverlichtingsmethode en de confocale verlichtingsmethode met laserscanning.
Daarom is in onderstaande figuur een praktische werkwijze van een moderne confocale microscoop weergegeven. Het door de laser uitgezonden excitatielicht gaat door een dichroïsche spiegel en scant in de x- en y-richting van het monster door een paar trillende spiegels. De excitatie (of reflectie) van het monster Het licht komt de PMT-detector binnen via het gaatje en wordt geregistreerd, en het opgenomen scanbeeld wordt door de computer gereconstrueerd om het daadwerkelijke monsterbeeld te verkrijgen.
