Het verschil tussen (twee-foton, confocale) fluorescentiemicroscoop en gewone microscoop
Het basisprincipe van excitatie met twee fotonen is dat fluorescerende moleculen bij hoge fotonendichtheid tegelijkertijd twee lange golflengtefotonen kunnen absorberen en een kortere golflengtefoton kunnen uitzenden na een korte periode van zogenaamde opgewekte staat levensduur; Het effect is hetzelfde als het gebruik van een foton met de helft van de golflengte van de lange golflengte om fluorescerende moleculen te prikkelen. Twee fotonenexcitatie vereist een hoge fotondichtheid, en om schadelijke cellen te voorkomen, gebruikt twee-fotonen microscopie met een hoge energie-modus vergrendelde pulslasers. De laser uitgezonden door deze laser heeft een hoge piekergie en een lage gemiddelde energie, met een pulsbreedte van slechts 100 femtoseconden en een frequentie van maximaal 80 tot 100 megahertz. Bij het gebruik van een hoge numerieke diafragma-objectieve lens om de fotonen van een gepulseerde laser te concentreren, is de fotondichtheid op het brandpunt van de objectieve lens de hoogste, en twee-foton excitatie vindt alleen plaats op het brandpunt van de objectieve lens. Daarom vereist de tweepotonenmicroscoop geen confocale pinhole, wat de efficiëntie van fluorescentiedetectie verbetert.
In het algemeen kan een fluorescentie -fenomenen, vanwege de lage fotondichtheid van het excitatielicht, een fluorescerend molecuul slechts één foton tegelijk absorberen en vervolgens een ander fluorescerend foton uitzenden door stralingsovergang, die bekend staat als enkele fotonenfluorescentie. Voor fluorescentie-excitatieprocessen die lasers gebruiken als lichtbronnen, kunnen twee-foton- of zelfs multiphoton fluorescentie-fenomenen optreden. In dit geval heeft de gebruikte excitatielichtbron een hoge intensiteit en fotondichtheid die voldoet aan de vereiste voor fluorescerende moleculen om twee fotonen tegelijkertijd te absorberen. In het proces van het gebruik van een algemene laser als excitatielichtbron, is de fotonichtheid nog steeds onvoldoende om het absorptieverschandfenomeen van twee fotonen te produceren. Meestal worden femtoseconde pulslasers gebruikt, waarbij onmiddellijk vermogen het megawatt -niveau bereikt. Daarom is de golflengte van twee-foton fluorescentie korter dan die van excitatielicht, equivalent aan het effect geproduceerd door halve excitatiegolflengte-excitatie.
Kennis gerelateerd aan confocale fluorescentiemicroscopie
Het basisprincipe van confocale fluorescentiemicroscopie is om een puntlichtbron te gebruiken om het monster te bestralen, waardoor een goed gedefinieerde kleine lichtvlek op het brandvlak wordt gevormd. De fluorescentie die vanaf deze plek wordt uitgezonden na bestraling wordt verzameld door de objectieve lens en teruggestuurd langs het oorspronkelijke bestralingspad naar de bundelsplitser samengesteld uit een dichroïsche spiegel. De spectrometer stuurt fluorescentie rechtstreeks naar de detector. Er is een pinhole voor zowel de lichtbron als de detector, respectievelijk de verlichting pinhole en de detectie -pinhole genoemd. De geometrische dimensies van de twee zijn consistent, ongeveer 100-200 nm; Vergeleken met de lichte plek op het brandvlak, zijn de twee geconjugeerd, wat betekent dat de lichte plek door een reeks lenzen gaat en zich uiteindelijk kan concentreren op zowel de verlichting pinhole als de detectie -pinhole tegelijkertijd. Op deze manier kan licht van het brandpuntsvlak samenkomen binnen het bereik van het detectiegat, terwijl verspreid licht van boven of onder het brandvlak buiten het detectiegat wordt geblokkeerd en niet kan worden afgebeeld. Door het monsterpunt voor punt met een laser te scannen, verkrijgt de fotomultiplicator buis na het detecteren van het pinhole ook het overeenkomstige confocale beeld van het lichtspotpunt voor punt, omzet het in een digitaal signaal en verzendt het naar de computer en verzamelt het uiteindelijk in een helder confocaal beeld van het gehele focusvlak op het scherm.
