Een vergelijking van verschillende superresolutiemicroscopietechnieken
Voor conventionele lichtmicroscopie beperkt diffractie van licht de beeldresolutie tot ongeveer 250 nm. Tegenwoordig kunnen superresolutietechnieken dit met meer dan een factor 10 verbeteren. Deze techniek wordt voornamelijk bereikt via drie methoden: single-molecule lokalisatiemicroscopie, inclusief fotogevoelige lokalisatiemicroscopie (PALM) en stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM); gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM); en gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED). Hoe u superresolutietechnologie kiest, dat is waar iedereen om geeft. "Helaas zijn er geen eenvoudige principes om te beslissen welke methode moet worden gebruikt", zegt Mathew Stracy, een postdoctoraal onderzoeker aan de Universiteit van Oxford, VK. "Elk heeft zijn eigen voor- en nadelen." Wetenschappers zijn natuurlijk ook aan het uitzoeken hoe ze de juiste methode voor een bepaald project kunnen kiezen. "In de context van bioimaging zijn de belangrijkste factoren waarmee rekening moet worden gehouden: ruimtelijke en temporele resolutie, gevoeligheid voor fotobeschadiging, labelcapaciteit, monsterdikte en achtergrondfluorescentie of autologe fluorescentie van cellen." Hoe het werkt De verschillende superresolutiemicroscopen werken op verschillende manieren. In het geval van PALM en STORM wordt slechts een klein deel van de fluorescerende markeringen op een bepaald moment geëxciteerd of foto-geactiveerd, waardoor hun onafhankelijke lokalisatie met hoge precisie mogelijk is. Het doorlopen van dit proces met alle fluorescerende labels resulteert in een compleet beeld met superresolutie. Stefan Hell, een van de winnaars van de Nobelprijs voor Scheikunde 2014 en directeur van het Max Planck Instituut voor Biofysische Chemie, zei: "Het PALM/STORM-systeem is relatief eenvoudig op te zetten, maar het is moeilijk toe te passen, omdat de fluorescerende groep moet fotoactiveringsvermogen hebben. Beperkingen Het nadeel is dat ze een enkel fluorescerend molecuul in de context van een cel moeten detecteren en minder betrouwbaar zijn dan STED. " STED gebruikt een laserpuls om de fluorofoor te exciteren en een ringvormige laser om de fluorofoor te doven, waardoor alleen de tussenliggende nanometer-sized fluorescentie overblijft voor superresolutie. Het scannen van het hele monster levert een afbeelding op. "Het voordeel van STED is dat het een drukknoptechnologie is", legt Hell uit. "Het werkt als een standaard confocale fluorescentiemicroscoop." Het kan ook levende cellen in beeld brengen met behulp van fluoroforen zoals groene of gele fluorescerende eiwitten en van rhodamine afgeleide kleurstoffen. Parametrische vergelijking Hoewel alle superresolutietechnieken qua resolutie de conventionele lichtmicroscopie overtreffen, verschillen ze van elkaar. SIM verdubbelt ruwweg de resolutie tot ongeveer 100 nm. PALM en STORM kunnen doelen van 15 nm oplossen. Volgens Hell biedt STED een ruimtelijke resolutie van 30 nm in levende cellen en 15 nm in vaste cellen. Als het om specifieke toepassingen gaat, moeten we ook rekening houden met de signaal-ruisverhouding. In sommige gevallen kan een lagere resolutie maar hogere SNR resulteren in een beter beeld dan het tegenovergestelde (hogere resolutie maar lagere SNR). De snelheid van beeldacquisitie is ook erg belangrijk, vooral voor levende cellen. "Alle superresolutietechnieken zijn langzamer dan conventionele fluorescentiebeeldvormingstechnieken, " zei Stracy. "PALM/STORM is de langzaamste, het heeft tienduizenden frames nodig om een enkel beeld te verkrijgen, SIM heeft tientallen frames nodig en STED is een scantechnologie, dus de acquisitiesnelheid hangt af van de grootte van het gezichtsveld." Naast levende cellen of vaste Imaging-cellen willen sommige wetenschappers ook begrijpen hoe objecten bewegen. Stracy is geïnteresseerd in het begrijpen van de dynamiek van biologische systemen in levende cellen, niet alleen in statische beelden. Hij combineert PALM met het volgen van afzonderlijke deeltjes om de dynamiek in levende cellen te analyseren. Op deze manier kan hij de markermoleculen direct volgen terwijl ze hun functies uitvoeren. Hij is echter van mening dat SIM niet geschikt is om deze dynamische processen op moleculair niveau te bestuderen, maar vanwege de hoge acquisitiesnelheid vooral geschikt is om de dynamiek van grotere structuren, zoals hele chromosomen, waar te nemen. De nieuwste resultaten In 2017 rapporteerde het Hell's team de MINFLUX superresolutiemicroscoop in Science. Volgens Hell bereikt deze superresolutiemethode voor het eerst een ruimtelijke resolutie van 1 nm. Bovendien kan het individuele moleculen in levende cellen minstens 100 keer sneller volgen dan andere methoden. Ook andere wetenschappers spraken lovend over de MINFLUX-microscoop. "Er worden voortdurend nieuwe toepassingen en benaderingen ontwikkeld, maar twee vorderingen vallen mij op", zei Shechtman. Een daarvan is MINFLUX. "Het gebruikt een ingenieuze methode om zeer nauwkeurige moleculaire positionering te krijgen." Met betrekking tot de tweede opwindende ontwikkeling noemde Shechtman WE Moerner en zijn collega's van Stanford University. Moerner was ook de ontvanger van de Nobelprijs voor scheikunde 2014. Een van de winnaars. Om de beperking van de beeldresolutie veroorzaakt door de anisotrope verstrooiing van fluorescerende afzonderlijke moleculen aan te pakken, gebruikten de wetenschappers verschillende excitatiepolarisaties om de oriëntatie en positie van de moleculen te bepalen. Bovendien hebben ze delicate pupiloppervlakken ontwikkeld. Deze technieken verbeteren het vermogen om structuren te lokaliseren. Over fluorescerende labels In veel toepassingen met superresolutie doen labels er echt toe. Er zijn ook enkele bedrijven die aanverwante producten leveren. Het Duitse Miltenyi werkt bijvoorbeeld samen met Abberior, een bedrijf opgericht door Stefan Hell, om op maat gemaakte antilichaamconjugatiediensten te leveren voor microscopiekleurstoffen met superresolutie. Een aantal andere bedrijven bieden ook bijpassende markeringen aan. "Onze Nano-Boosters zijn erg klein, slechts 1,5 kDa, en zeer specifiek", zegt Christoph Eckert, marketingmedewerker bij ChromoTek. Deze eiwitten binden groen en rood fluorescerende eiwitten (GFP en RFP). Ze zijn afgeleid van alpaca-antilichaamfragmenten, bekend als VHH of nanobodies, met uitstekende bindingseigenschappen en stabiele kwaliteit zonder variatie van batch tot batch. Deze markers zijn geschikt voor verschillende superresolutietechnieken, waaronder SIM, PALM, STORM en STED. Ai-Hui Tang, een assistent-professor aan de University of Maryland School of Medicine, en collega's gebruikten ChromoTek's GFP-Booster en STORM om de verspreiding van informatie in het zenuwstelsel te onderzoeken. Ze vonden moleculaire nanoclusters, nanokolommen genaamd, in presynaptische en postsynaptische neuronen. De wetenschappers geloven dat deze structuur aantoont dat het centrale zenuwstelsel eenvoudige principes hanteert om de synaptische efficiëntie te handhaven en te reguleren. Verschillende versies van beeldvorming met superresolutie en een groeiend aantal methoden brengen wetenschappers nog dieper in biologische mysteries. Door de diffractielimiet van zichtbaar licht te doorbreken, kunnen biologen zelfs de acties van cellen "nauwlettend volgen".
