Bepaling van het aantal micro-organismen - de directe telmethode van de microscoop!
Bacteriële populatiegroei manifesteert zich door een toename van het aantal cellen of een toename van de cellulaire massa. De methoden voor het bepalen van het aantal cellen omvatten de directe microscooptelmethode, de plaatkolonietelmethode, de foto-elektrische olieverhoudingsmethode, de maximale waarschijnlijkheidsmethode en de membraanfiltratiemethode. De methoden voor het meten van celmaterie omvatten de bepaling van het drooggewicht van de cel, de bepaling van bepaalde cellulaire componenten zoals stikstof-, RNA- en DNA-inhoud, en de bepaling van metabolieten. Kortom, er zijn vele methoden om de groei van micro-organismen te meten, elk met zijn eigen voor- en nadelen, en moeten worden gekozen op basis van de specifieke situatie. Dit experiment introduceert hoofdzakelijk de directe telmethode van de microscoop die gewoonlijk wordt gebruikt in productie en wetenschappelijk onderzoek.
1. Doelvereisten
1. Verduidelijk het principe van het aantal bloedcellen.
2. Beheers de methode van het tellen van micro-organismen met behulp van een bloedcelteller.
2. Basisprincipes
De directe telmethode met een microscoop is een eenvoudige, snelle en intuïtieve methode om direct een kleine hoeveelheid suspensie van het te testen monster te tellen op een speciaal objectglaasje met een bepaald oppervlak en volume (ook wel bacterieteller genoemd). methoden. Momenteel zijn de veelgebruikte bacterietellers in binnen- en buitenland: bloedceltelbord, Peteroff-Hauser-bacterieteller en Hawksley-bacterieteller, enz. Ze kunnen worden gebruikt voor het tellen van gist, bacteriën, schimmelsporen en andere suspensies, en het basisprincipe is hetzelfde. De laatste twee typen bacterietellers hebben een totaal volume van 0.02 mm3 nadat ze zijn afgedekt met een dekglas, en de afstand tussen het dekglas en het objectglaasje is slechts 0,02 mm, dus de olie onderdompelingsobjectief kan worden gebruikt om kleine cellen zoals bacteriën te observeren en te observeren. graaf. Naast deze bacteriometers is er ook een schattingsmethode voor de verhouding van het oppervlak van het uitstrijkje tot het gebied van het gezichtsveld dat direct onder de microscoop wordt waargenomen, die over het algemeen wordt gebruikt voor bacteriologisch onderzoek van melk. De voordelen van de directe telmethode onder de microscoop zijn intuïtief, snel en eenvoudig te bedienen. Het nadeel van deze methode is echter dat het meetresultaat meestal de som is van dode en levende cellen. Momenteel zijn er enkele methoden om deze tekortkoming te verhelpen, zoals de combinatie van levensvatbare bacteriën die microkamercultuur kleuren (korte tijd) en de toevoeging van celdelingsremmers om het doel te bereiken om alleen levensvatbare bacteriën te tellen.
In dit experiment werd een hemocytometer gebruikt als voorbeeld voor directe microscopische telling. Voor het gebruik van de andere twee typen bacterietellers verwijzen wij u naar de instructies van elke fabrikant. Direct onder de microscoop tellen met een hemocytometer is een veelgebruikte methode om micro-organismen te tellen. De telplaat is een speciale glazen schuif, waarop drie plateaus worden gevormd door vier sleuven; het bredere platform in het midden is door een korte dwarsgleuf in twee helften verdeeld en aan weerszijden van het platform bevindt zich een rooster. Elk rooster is verdeeld in negen grote vierkanten en het grote vierkant in het midden is de telkamer. De structuur van de plaat voor het tellen van bloedcellen wordt getoond in figuur l{{{{10}}}}. De schaal van de telkamer heeft over het algemeen twee specificaties: één is een groot vierkant verdeeld in 25 middelste vierkanten en elk middelste vierkant is verdeeld in 16 kleine vierkanten (Afbeelding 15-2); de andere is een groot plein. Het vierkant is verdeeld in 16 middelste vierkanten en elk middelste vierkant is verdeeld in 25 kleine vierkanten, maar wat voor telbord het ook is, er zijn 400 kleine vierkanten in elk groot vierkant. De zijlengte van elk groot vierkant is 1 mm en de oppervlakte van elk groot vierkant is 1 mm2. Na afdekking met een dekglas is de hoogte tussen het dekglas en het schuifglas 0,1 mm, dus het volume van de telkamer is 0,1 mm3 (een duizendste van een milliliter). Figuur 15-1 De structuur van het bloedceltelbord (1) Figuur 15-2 De structuur van het bloedceltelbord (2) A. Vooraanzicht; B. Langsdoorsnede; Het vergrote rooster, het grote vierkant in het midden is de telkamer 1. Bloedcellen Telplaat; 2. Afdekglas; 3. Tel bij het tellen in de telkamer meestal het totale aantal bacteriën in vijf vierkanten, bereken vervolgens het gemiddelde van elk vierkant en vermenigvuldig dit met 25 of 16 om het totale aantal bacteriën in een groot vierkant te krijgen. totaal aantal bacteriën in 1 ml bacteriële oplossing. Laat het totale aantal bacteriën in de vijf vierkanten A zijn en de verdunningsverhouding van de bacterieoplossing B. Als het een telbord is met 25 vierkanten, het totale aantal bacteriën in 1 ml bacterieoplossing {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(stuks) Evenzo, als het een telbord is met 16 middelgrote vierkanten, het totale aantal bacteriën in 1 ml bacterieoplossing=A/ 5×16×104×B=32000A·B (stuks)
3. Uitrusting
1. Bacteriën
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenten of andere gebruiksvoorwerpen
Hemocytometer, microscoop, dekglaasje, steriele capillaire druppelaar.
4. Bedieningsstappen
1. Bereiding van bacteriële suspensie
Saccharomyces cerevisiae werd met steriele fysiologische zoutoplossing bereid tot een bacteriële suspensie met een geschikte concentratie.
2. Microscooptelkamer
Voordat u monsters toevoegt, inspecteert u de telkamer van de telplaat microscopisch. Als er vuil is, moet het vóór het tellen worden schoongemaakt en gedroogd.
3. Monster toevoegen
Bedek de schone en droge hemocytometer met een dekglaasje en gebruik vervolgens een steriele capillaire druppelaar om een kleine druppel van de geschudde Saccharomyces cerevisiae-suspensie van de rand van het dekglaasje te laten vallen, en laat de bacteriële oplossing automatisch langs de opening bewegen door capillaire osmose. Bij het betreden van de telkamer kan de algemene telkamer worden gevuld met bacteriële vloeistof. Schud bij het bemonsteren eerst de bacterieoplossing; bij het toevoegen van monsters mogen er geen luchtbellen in de telkamer ontstaan.
4. Microscooptelling
Nadat u het monster hebt toegevoegd, blijft u 5 minuten staan, plaatst u de hemocytometer op het microscoopplatform, zoekt u eerst de locatie van de telkamer met een microscoop met laag vermogen en schakelt u vervolgens over op een microscoop met hoog vermogen om te tellen. Pas de intensiteit van het microscooplicht op de juiste manier aan. Voor microscopen die spiegels gebruiken voor verlichting, let op dat u niet van één kant van het licht afwijkt, anders zal het niet gemakkelijk zijn om de vierkante lijnen van de telkamer duidelijk in het gezichtsveld te zien, of alleen verticale lijnen of horizontale lijnen zullen gezien worden. Als blijkt dat de bacterieoplossing vóór het tellen te geconcentreerd of te verdund is, moet de verdunning vóór het tellen worden bijgesteld. Over het algemeen vereist de verdunning van het monster ongeveer 5 tot 10 bacteriën in elke kleine cel. Elke telkamer selecteert 5 middelste cellen (optioneel 4 hoeken en één middelste cel in het midden) om te tellen. De cellen op de rasterlijn worden over het algemeen alleen op de bovenste en rechter lijn geteld. In het geval van gistontluiking, wanneer de grootte van de knop de helft van de moedercel bereikt, wordt deze geteld als twee bacteriecellen. Om een monster te tellen, berekent u het bacteriegehalte van het monster door de gemiddelde waarde van de twee telkamers te berekenen.
5. Was het aantal bloedcellen
Spoel het bloedplaatjesbord na gebruik af met water in de kraan, schrob niet met harde voorwerpen en droog het na het wassen zelf of met een föhn af. Microscopisch onderzoek om te zien of er achtergebleven bacteriën of andere sedimenten in elke kleine cel zitten. Als het niet schoon is, moet het herhaaldelijk worden gewassen totdat het schoon is.
