Kennis over confocale fluorescentiemicroscopie
Het basisprincipe van confocale fluorescentiemicroscopie: een puntlichtbron wordt gebruikt om het preparaat te bestralen en er wordt een goed gedefinieerde kleine lichtvlek gevormd op het brandpuntsvlak. samengesteld uit splitters. De bundelsplitser stuurt de fluorescentie rechtstreeks naar de detector. Er is een gaatje voor de lichtbron en de detector, respectievelijk het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje genoemd. De geometrische afmeting van de twee is hetzelfde, ongeveer 100-200nm; ten opzichte van de lichtvlek op het brandpuntsvlak zijn de twee geconjugeerd, dat wil zeggen, de lichtvlek gaat door een reeks lenzen en kan uiteindelijk tegelijkertijd worden gefocust op het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje. Op deze manier kan het licht van het brandvlak binnen het bereik van het detectiegat worden geconvergeerd, terwijl het verstrooide licht van boven of onder het brandvlak buiten het detectiegat wordt geblokkeerd en niet kan worden afgebeeld. De laser scant het monster punt voor punt en de fotovermenigvuldigerbuis verkrijgt na detectie van het gaatje ook punt voor punt het confocale beeld van het overeenkomstige licht, dat wordt omgezet in een digitaal signaal en naar de computer wordt verzonden, en uiteindelijk wordt samengevoegd tot een helder confocaal beeld van het gehele brandpuntsvlak op het scherm.
Elk brandpuntsvlakbeeld is eigenlijk een optische dwarsdoorsnede van het preparaat, en deze optische dwarsdoorsnede heeft altijd een bepaalde dikte, ook wel een optische dunne doorsnede genoemd. Aangezien de lichtintensiteit bij het brandpunt veel groter is dan die bij het niet-focuspunt, en het niet-brandpuntsvlaklicht wordt gefilterd door het gaatje, is de scherptediepte van het confocale systeem ongeveer nul en scant langs de Z -as kan optische tomografie realiseren en vormt een Observeer de tweedimensionale optische sectie op de gefocuste plek van het monster. Door XY-vlak (brandpuntsvlak) scannen te combineren met Z-as (optische as) scannen, kan het driedimensionale beeld van het monster worden verkregen door tweedimensionale beelden van continue lagen te verzamelen en te verwerken met speciale computersoftware.
