Kennis over twee-fotonenfluorescentiemicroscopie
Het basisprincipe van excitatie met twee- fotonen is dat fluorescerende moleculen bij een hoge fotonendichtheid tegelijkertijd twee fotonen met een lange golflengte kunnen absorberen en een foton met een kortere golflengte kunnen uitzenden na een korte periode van de -zogenaamde levensduur van de geëxciteerde toestand; Het effect is hetzelfde als het gebruik van een foton met de helft van de golflengte van de lange golflengte om fluorescerende moleculen te exciteren. Excitatie van twee fotonen vereist een hoge fotonendichtheid, en om schade aan cellen te voorkomen, maakt twee-fotonenmicroscopie gebruik van hoge-energiemodus-vergrendelde pulslasers. De door deze laser uitgezonden laser heeft een hoge piekenergie en een lage gemiddelde energie, met een pulsbreedte van slechts 100 femtoseconden en een frequentie van maximaal 80 tot 100 megahertz. Wanneer een objectieflens met een hoge numerieke opening wordt gebruikt om de fotonen van een gepulseerde laser te focusseren, is de fotonendichtheid op het brandpunt van de objectieflens het hoogst, en vindt excitatie van twee-fotonen alleen plaats in het brandpunt van de objectieflens. Daarom heeft de twee-fotonenmicroscoop geen confocaal gaatje nodig, wat de efficiëntie van fluorescentiedetectie verbetert.
Bij algemene fluorescentieverschijnselen kan een fluorescerend molecuul, vanwege de lage fotondichtheid van het excitatielicht, slechts één foton tegelijk absorberen en vervolgens een ander fluorescerend foton uitzenden via stralingsovergang, die bekend staat als fluorescentie van enkele fotonen. Bij fluorescentie-excitatieprocessen waarbij lasers als lichtbron worden gebruikt, kunnen twee-fotonen- of zelfs multifoton-fluorescentieverschijnselen optreden. In dit geval heeft de gebruikte excitatielichtbron een hoge intensiteit en fotonendichtheid die voldoet aan de eis dat fluorescerende moleculen tegelijkertijd twee fotonen moeten absorberen. Bij het gebruik van een algemene laser als excitatielichtbron is de fotonendichtheid nog steeds onvoldoende om twee-fotonenabsorptieverschijnselen te produceren. Meestal worden femtoseconde-pulslasers gebruikt, waarbij het onmiddellijke vermogen het megawatt-niveau bereikt. Daarom is de golflengte van twee- fotonenfluorescentie korter dan die van excitatielicht, equivalent aan het effect dat wordt geproduceerd door excitatie met een halve excitatiegolflengte.
