Kennis van de confocale fluorescentiemicroscoop
Het basisprincipe van confocale fluorescentiemicroscopie: een puntlichtbron wordt gebruikt om het monster te bestralen, waardoor een klein, goed gedefinieerd lichtpunt op het brandvlak ontstaat; de fluorescentie die na bestraling vanaf dit punt wordt uitgezonden, wordt opgevangen door de objectieflens en teruggestuurd langs het oorspronkelijke bestralingslichtpad naar de bundelsplitser die bestaat uit een bidirectionele chromatische spiegel. De bundelsplitser stuurt de fluorescentie rechtstreeks naar de detector. Zowel de lichtbron als de detector hebben elk een gaatje ervoor, respectievelijk het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje. Beide hebben dezelfde geometrie, ongeveer 100-200 nm, en zijn geconjugeerd met betrekking tot het lichtpunt op het brandpuntsvlak, dat wil zeggen dat het lichtpunt door een reeks lenzen gaat en uiteindelijk kan worden scherpgesteld op zowel het verlichtende als het lichtpunt. en detectorgaatjes. Op deze manier kan licht uit het brandpuntsvlak convergeren binnen de sonde-opening, terwijl verstrooid licht van boven of onder het brandvlak buiten de sonde-opening wordt geblokkeerd en niet kan worden afgebeeld. De laser scant het monster punt voor punt, en de fotovermenigvuldigerbuis verkrijgt na het detecteren van het gaatje ook punt voor punt het confocale beeld van het overeenkomstige licht, dat wordt omgezet in een digitaal signaal en naar de computer wordt verzonden, en uiteindelijk convergeert naar een helder beeld. confocaal beeld van het gehele brandvlak op het scherm.
Elk beeld in het brandvlak is eigenlijk een optische dwarsdoorsnede van het preparaat, en deze optische dwarsdoorsnede heeft altijd een bepaalde dikte, ook wel een optische plaat genoemd. Omdat de lichtintensiteit op het brandpunt veel groter is dan die op het niet-brandpunt, en het licht uit het niet-brandpuntsvlak wordt uitgefilterd door het gaatje, wordt de scherptediepte van het confocale systeem geschat op nul, en wordt er gescand langs de Z-asrichting maakt het mogelijk dat optische tomografie een tweedimensionale optische plak van het monster vormt dat op het brandpunt moet worden waargenomen. Door het scannen van het XY-vlak (brandpuntsvlak) te combineren met scannen op de Z-as (optische as), kan een driedimensionaal beeld van het monster worden verkregen door opeenvolgende lagen van tweedimensionale beelden te accumuleren, die worden verwerkt door gespecialiseerde computersoftware.
Dit betekent dat het detectiegaatje en het gaatje van de lichtbron altijd op hetzelfde punt zijn gefocusseerd, zodat fluorescentie die buiten het brandpuntsvlak wordt geëxciteerd het detectiegaatje niet kan binnendringen.
Het werkingsprincipe van laserconfocaal wordt eenvoudigweg uitgedrukt dat het laser als lichtbron gebruikt, op basis van traditionele fluorescentiemicroscoopbeeldvorming, een extra laserscanapparaat en een geconjugeerd focusseringsapparaat, via computerbesturing om een digitaal beeldverwervings- en verwerkingssysteem uit te voeren.
