Laserconfocale microscoopfuncties en toepassingen
Terwijl bij een normale microscoop het beeldvlak van de waarneming wordt geïsoleerd van de aangrenzende axiale vlakken door het brandpuntsvlak van de objectieflens met de detector te overlappen, wordt deze isolatie bij een confocale microscoop bereikt door het monster te belichten met een diffractie-begrensd punt van licht en het filteren van strooilicht door een gaatje te gebruiken in het pad van het verzamelde licht in het geconjugeerde brandpunt van dit lichtpunt om deze isolatie te bereiken en zo de resolutie te verbeteren.
Alleen het licht dat door de geconjugeerde monsterlaag wordt teruggekaatst, kan door het gaatje in het verzamellichtpad passeren, terwijl de rest van de irrelevante reflecties van de monsterlaag door het gaatje wordt geblokkeerd. Dit geeft een aanzienlijke verhoging van de resolutie. Hieronder wordt een vergelijking naast elkaar weergegeven van multidimensionale fluorescentiemicroscopie en confocale microscopie van hetzelfde dikke monster. Wanneer een reeks beelden op verschillende brandpuntsvlakken wordt gemaakt, wordt een beeld geproduceerd dat gewoonlijk een "z-stack" wordt genoemd, dat de resolutie- en contrastwinsten toont die worden geleverd door confocale microscopie en de onderliggende redenen voor deze winsten. Het is te zien dat het onderzoeken van het beeld bovenaan de stapel, waar het beeldvlak zich boven het weefsel bevindt, een grote hoeveelheid verstrooid licht in het fluorescentiebeeld onthult, terwijl het confocale microscoopbeeld er zwart uitziet. Deze vermindering van PSF in de axiale richting draagt rechtstreeks bij aan het verschil in resolutie dat wordt waargenomen bij de optische interface in het midden van de z-stapel.
Optische slice-scanning
Een ander kenmerk van confocale microscopie met laserscanning is dat het een scanning-beeldvormingstechniek is. Traditionele breedveldverlichtingstechnieken verlichten het hele monster, zodat het beeld rechtstreeks met het blote oog of een detector kan worden vastgelegd, maar LSCM gebruikt een of meer gefocusseerde lichtbundels om door het monster te scannen, zodat het resulterende beeld een optische plak, zoals weergegeven in het volgende diagram. Het verschil tussen traditionele breedveldverlichting en confocale laserscanning wordt hieronder weergegeven.
Daarom wordt een praktische manier van moderne confocale microscopie weergegeven in de onderstaande figuur. Het excitatielicht van de laser wordt door een dichroïsche spiegel geleid en gescand door een paar galvanometerspiegels in de x-richting en y-richting van het monster, en de excitatie (of reflectie) van het monster gaat door een gaatje in de PMT detector die moet worden opgenomen, en het opgenomen gescande beeld wordt gereconstrueerd door een computer om een feitelijk beeld van het monster te produceren.
