Laserconfocale microscopie - kenmerken en toepassingen
Laserscanning confocale microscopie (LSCM) is een type microscoop ontworpen op basis van conjugaatfocustechnologie, dat wil zeggen dat de laserlichtbron, het te meten monster en de detector zich allemaal in geconjugeerde posities ten opzichte van elkaar bevinden.
Fundamenteel
Bij een algemene microscoop wordt het beeldvlak van observatie geïsoleerd van het aangrenzende axiale vlak door het brandpuntsvlak van de objectieflens samen te laten vallen met de detector, terwijl bij een confocale microscoop een diffractiebeperkte lichtvlek wordt gebruikt om het monster te verlichten en A Er wordt een gaatje gebruikt in het verzamelde lichtpad bij de conjugaatfocus van de lichtvlek om strooilicht te filteren om dit isolatie-effect te creëren en daardoor de resolutie te verbeteren.
Beeldfuncties
Scannen van optische secties
Een ander kenmerk van confocale microscopie met laserscanning is dat het een scanning-beeldvormingstechnologie is. De traditionele breedveldverlichtingstechnologie verlicht het hele monster, zodat het beeld rechtstreeks met het blote oog of een detector kan worden vastgelegd, maar LSCM gebruikt een straal of meerdere gefocusseerde stralen gaan door het monster om te scannen en af te beelden. Het resulterende beeld wordt een optische sectie genoemd. Het volgende toont het verschil tussen de traditionele breedveldverlichtingsmethode en de confocale verlichtingsmethode met laserscanning.
Daarom is een feitelijke werkwijze van een moderne confocale microscoop zoals weergegeven in de onderstaande figuur. Het door de laser uitgezonden excitatielicht gaat door een dichroïsche spiegel en wordt door een paar galvanometers in de x-richting en de y-richting van het monster gescand. De excitatie (of reflectie) van het monster is Licht komt de PMT-detector binnen via het gaatje en wordt opgenomen, en het opgenomen gescande beeld wordt door een computer gereconstrueerd om het werkelijke monsterbeeld te reconstrueren.
Genereer "z-stack"-afbeeldingen op verschillende focusvlakken
Alleen het door de geconjugeerde monsterlaag teruggekaatste licht kan door het kleine gaatje in het verzamellichtpad gaan, en de overige irrelevante reflecties van de monsterlaag worden door het kleine gaatje geblokkeerd. Dit kan resulteren in aanzienlijke resolutieverbeteringen. Zij-aan-zij vergelijking van multidimensionale fluorescentiemicroscopie en confocale microscopie van hetzelfde dikke monster. Wanneer een reeks beelden op verschillende brandpuntsvlakken wordt gemaakt, kunnen beelden worden gegenereerd die gewoonlijk "z-stacks" worden genoemd, die de resolutie- en contrastwinsten illustreren die worden geboden door confocale microscopie en de onderliggende oorzaken van deze winsten. Het is te zien dat het onderzoeken van het beeld bovenaan de stapel met het beeldvlak boven het weefsel een grote hoeveelheid verstrooid licht in het fluorescentiebeeld onthult, terwijl het confocale microscopiebeeld er zwart uitziet. Deze vermindering van de axiale PSF resulteert direct in het resolutieverschil dat wordt waargenomen bij de optische interface in het midden van de z-stack.
De resolutie is aanzienlijk verbeterd vergeleken met breedveldverlichting
Bij fluorescentiemicroscopie wordt de lichtintensiteit die door een enkel punt wordt uitgezonden beschreven door de puntspreidingsfunctie (PSF), en het patroon ervan is een Airy-schijf. De resolutie van het fluorescentiesysteem kan worden beschreven door de straal van de Airy-schijf, die kan worden beschreven door de numerieke opening van de objectieflens en de golflengte van het excitatielicht bepalen
