Principes van laserconfocale microscopie (LSCM)
Een laserconfocale microscoop maakt gebruik van een verlichtingsgaatje achter de lichtbron en een detectiegaatje voor de detector om puntverlichting en puntdetectie te bereiken. Licht van de lichtbron wordt gefocusseerd op een punt in het brandpuntsvlak van het monster door licht dat door het verlichtingsgaatje wordt uitgezonden, en de vanaf dat punt uitgezonden fluorescentie wordt afgebeeld in het detectiegaatje, en al het uitgestraalde licht buiten dat punt wordt geblokkeerd door de detectie gaatje. Het verlichtingsgaatje en het detectiegaatje zijn geconjugeerd voor het verlichte of gedetecteerde punt, zodat het gedetecteerde punt het confocale punt is en het vlak waar het gedetecteerde punt zich bevindt het confocale vlak is. De computer geeft het gedetecteerde punt op het computerscherm weer in de vorm van een beeldpunt. Om een compleet beeld te produceren, scant een scansysteem in het optische pad over het brandpuntsvlak van het monster, waardoor een volledig confocaal beeld wordt geproduceerd. Zolang het draagvlak langs de Z-as op en neer wordt bewogen, wordt een nieuw niveau van het monster naar het confocale vlak verplaatst en wordt het nieuwe niveau van het monster op de monitor weergegeven, terwijl de Z-as doorgaat met bewegen. bewegen, worden opeenvolgende lichtsnedebeelden van verschillende niveaus van het monster verkregen.
De traditionele optische microscoop maakt gebruik van een veldlichtbron; het beeld van elk punt op het preparaat wordt verstoord door de diffractie of verstrooiing van licht van de aangrenzende punten; Laserscanning confocale microscoop gebruikt een laserstraal door het verlichte gaatje om een puntlichtbron te vormen op het monster dat is gescand op elk punt van het interne brandpuntsvlak, het monster op het bestraalde punt, de afbeelding van het detectiegaatje, door de detectie van gaatje na het point of light multiplication tube (PMT) of cold electrocoupled device (cCCD). Punt voor punt of lijn voor lijn ontvangen, wordt snel een fluorescerend beeld gevormd op het computermonitorscherm. Verlichtingsgaatje en detectiegaatje ten opzichte van het brandpuntsvlak van de objectieflens zijn geconjugeerd, het punt op het brandpuntsvlak is tegelijkertijd gefocust op het verlichtingsgaatje en het emissiegaatje, het punt buiten het brandpuntsvlak zal niet in de detectie van de gaatje bij de beeldvorming, zodat het verkregen confocale beeld de optische dwarsdoorsnede van het monster is, waardoor de tekortkomingen van het gewone microscoopbeeld wazig worden overwonnen.
Vanuit het basisprincipe is de laserconfocale microscoop een moderne optische microscoop, het is de gewone lichtmicroscoop van de technologie om de volgende verbeteringen aan te brengen.
1. Gebruik laser als lichtbron omdat de monochromaticiteit van de laser zeer goed is, de golflengte van de lichtbronbundel is hetzelfde, waardoor de chromatische aberratie fundamenteel wordt geëlimineerd.
2. Het gebruik van confocale technologie in het brandpuntsvlak van de objectieflens, in het midden geplaatst met een klein gaatje in het schot, waarbij het brandpuntsvlak buiten het strooilicht wordt geblokkeerd, waardoor de sferische aberratie wordt geëlimineerd; en elimineer verder de chromatische aberratie.
3. Confocale lasermicroscoop die gebruik maakt van puntscantechnologie om het monster in tweedimensionale of driedimensionale ruimte op te splitsen in talloze punten, met een zeer kleine laserstraal (puntlichtbron) punt voor punt, lijn voor lijn scanning, en vervolgens door de microcomputercombinatie van een heel vlak of driedimensionaal beeld. De traditionele lichtmicroscoop is een veldlichtbron onder de eenmalige beeldvorming; monsters op elk punt van het beeld grenzen aan het punt van diffractielicht en verstrooide lichtinterferentie. De helderheid en precisie van deze twee beelden zijn niet te vergelijken.
4. Opname en verwerking van optische signalen met een computer en versterking van de signalen met een fotovermenigvuldigingsbuis
Bij de laser confocale microscoop vervangt de computer het menselijk oog of de camera voor observatie en video-opname, en worden de verkregen beelden gedigitaliseerd en kunnen in de computer worden verwerkt om de helderheid van de beelden weer te verbeteren. Bovendien kan het gebruik van fotomultiplicatorbuizen zeer zwakke signalen versterken, waardoor de gevoeligheid aanzienlijk wordt verbeterd. Als resultaat van het gecombineerde gebruik van bovengenoemde technologieën kan worden gezegd dat de LSCM de meest geavanceerde microscoop ter wereld is. Er kan worden gezegd dat LSCM de combinatie is van microscoopproductietechnologie, foto-elektrische technologie en computertechnologie **, het onvermijdelijke product is van de ontwikkeling van moderne technologie.
