Standaardprocedure voor het kalibreren van polarisatoren in een polarisatiemicroscoop
De fluorescentiemicroscoop verschilt van de gewone optische microscoop doordat deze geen monsters observeert onder de verlichting van gewone lichtbronnen. In plaats daarvan gebruikt het een bepaalde golflengte van licht (meestal ultraviolet licht, blauwviolet licht) om de fluorescerende stoffen in het monster onder de microscoop te exciteren, waardoor ze fluorescentie uitstralen. Daarom is de rol van de lichtbron in de fluorescentiemicroscoop niet de directe verlichting, maar die van een energiebron om de fluorescerende stoffen in het preparaat te exciteren. De reden waarom we monsters kunnen observeren is niet te wijten aan de verlichting van de lichtbron, maar aan het fluorescentieverschijnsel dat wordt vertoond door de fluorescerende stoffen in het monster na het absorberen van de opgewonden lichtenergie. Hieruit kan worden opgemaakt dat het kenmerk van fluorescentiemicroscopie hoofdzakelijk is dat de lichtbron ervan een grote hoeveelheid excitatielicht in een specifiek golflengtebereik kan leveren, zodat de fluorescerende stoffen in het preparaat de noodzakelijke intensiteit van excitatielicht kunnen verkrijgen. Tegelijkertijd moeten fluorescentiemicroscopen over overeenkomstige filtersystemen beschikken. Fluorescentiemicroscoop is een fundamenteel hulpmiddel in de chemie van fluorescentieweefsel. Het bestaat uit hoofdcomponenten zoals een lichtbron met ultra-hoogspanning, een filtersysteem (inclusief excitatie- en onderdrukkingsfilterplaten), een optisch systeem en een fotografiesysteem. Het gebruikt licht van een bepaalde golflengte om het monster te prikkelen en fluorescentie uit te zenden.
1. Methoden voor fluorescentie-excitatie: Afhankelijk van het golflengtebereik van licht zijn er twee typen: UV-excitatiemethode (met behulp van ultraviolette verlichting) en BV-excitatiemethode (met behulp van blauwviolet licht). De UV-excitatiemethode maakt gebruik van bijna-ultraviolet licht korter dan 400 nm voor excitatie. Deze methode heeft geen zichtbaar excitatielicht, dus de waargenomen fluorescentie vertoont de inherente fluorescentie van de kleurstof, waardoor het gemakkelijk wordt om de specifieke fluorescentie op het monster te onderscheiden van de zelffluorescentie van het achtergrondweefsel.
2. BV-excitatiemethode: het omvat excitatie van ultraviolet naar blauw licht gecentreerd op 404 nm en 434 nm. Deze methode maakt gebruik van blauw licht om het monster te bestralen, dus het afsnijfilter-van het fluorescentieobservatiesysteem moet een filter gebruiken dat blauw licht volledig kan blokkeren en volledig door de vereiste groene en gele fluorescentie kan gaan. Fluorescerende pigmenten gebruikt voor de fluorescerende antilichaammethode. De maximale absorptiegolflengte van excitatielicht en de maximale emissiegolflengte van fluorescentie liggen relatief dichtbij, dus het filter dat wordt gebruikt in de BV-excitatiemethode moet een scherp gesneden filter gebruiken. Bij deze methode kan blauw licht als excitatielicht worden gebruikt, zodat de absorptie-efficiëntie van fluorescerende pigmenten hoog is en er helderdere beelden kunnen worden verkregen. Het nadeel is dat fluorescentie onder 500 nm niet zichtbaar is, terwijl fluorescentie boven 500 nm ervoor zorgt dat het hele beeld geel lijkt. Bij de fluorescerende antilichaammethode wordt de specificiteit meestal bepaald door de kleur die uniek is voor fluorescerende pigmenten, dus bij het bespreken van subtiele specificiteit hebben de hierboven genoemde nadelen van de BV-excitatiemethode vaak een aanzienlijke impact.
