Twee veelgebruikte microscopische observatiemethoden
1, Donkerveldobservatie
Donker gezichtsveld is eigenlijk donkerveldverlichting. De kenmerken zijn anders dan helder gezichtsveld, omdat het niet direct het verlichtende licht waarneemt, maar eerder het gereflecteerde of verstrooide licht van het te inspecteren object waarneemt. Daarom wordt het gezichtsveld een donkere achtergrond, terwijl het te inspecteren object een helder beeld weergeeft
Het principe van het donkerveld is gebaseerd op het optische Tyndall-fenomeen, waarbij stofdeeltjes bij blootstelling aan sterk licht niet door het menselijk oog kunnen worden waargenomen als gevolg van diffractie veroorzaakt door sterk licht. Als het licht er schuin op wordt geprojecteerd, lijken de deeltjes in volume toe te nemen als gevolg van de reflectie van licht, waardoor ze zichtbaar worden voor het menselijk oog
Het speciale accessoire dat nodig is voor donkerveldobservatie is een donkerveldschijnwerper. Het kenmerk is dat deze de lichtstraal niet van onder naar boven door het object laat gaan, maar het pad van het licht verandert zodat het schuin naar het object wordt gericht, zodat het verlichtingslicht niet direct de objectieflens binnendringt, en gebruik maakt van het heldere beeld dat wordt gevormd door het reflectie- of diffractielicht op het oppervlak van het te inspecteren object. De resolutie van donkerveldobservatie is veel hoger dan die van helderveldobservatie, tot wel 0,02-0,004
2, Fasecontrastspiegelinspectiemethode
De succesvolle uitvinding van fasecontrastmicroscopie bij de ontwikkeling van optische microscopen is een belangrijke prestatie in de moderne microscopietechnologie. We weten dat het menselijk oog alleen de golflengte (kleur) en amplitude (helderheid) van lichtgolven kan onderscheiden. Bij kleurloze en transparante biologische specimens veranderen de golflengte en amplitude niet veel wanneer er licht doorheen gaat, waardoor het moeilijk wordt om het specimen in een helder veld waar te nemen
De fasecontrastmicroscoop gebruikt het verschil in optische weglengte van het object dat wordt geïnspecteerd voor spiegelinspectie, waarbij effectief gebruik wordt gemaakt van het interferentiefenomeen van licht om het faseverschil dat niet door het menselijk oog kan worden onderscheiden, om te zetten in een onderscheidbaar amplitudeverschil. Zelfs kleurloze en transparante stoffen kunnen duidelijk zichtbaar worden. Dit vergemakkelijkt de observatie van levende cellen enorm, daarom wordt fasecontrastmicroscopie veel gebruikt in omgekeerde microscopen
Het basisprincipe van fasecontrastmicroscopie is het omzetten van het optische padverschil van zichtbaar licht dat door het preparaat gaat, in amplitudeverschil, waardoor het contrast tussen verschillende structuren wordt verbeterd en ze duidelijk en zichtbaar worden gemaakt. Na door het preparaat te zijn gegaan, ondergaat het licht breking, afwijkend van het oorspronkelijke optische pad en vertraagd met 1/4 λ (golflengte). Als het optische padverschil met nog eens 1/4 λ wordt vergroot of verkleind, wordt het optische padverschil 1/2 λ en neemt de interferentie tussen de twee lichtbundels toe of af nadat de as is gecombineerd, waardoor het contrast wordt verbeterd. Qua structuur hebben fasecontrastmicroscopen twee
bijzondere verschillen met gewone optische microscopen:
1. Tussen de lichtbron en de condensor bevindt zich een ringvormig diafragma. Zijn functie is het vormen van een holle lichtkegel die door de condensor gaat en zich op het preparaat concentreert
2. Hoekige faseplaat: Een faseplaat bedekt met magnesiumfluoride wordt aan de objectieflens toegevoegd, die de fase van direct of diffractielicht met 1/4 λ kan vertragen. Het kan in twee soorten worden verdeeld:
(1) . A+faseplaat: Vertraag het directe licht met 1/4 λ en voeg de twee sets lichtgolven toe na het combineren van de assen. De amplitude neemt toe en de structuur van het monster wordt helderder dan het omringende medium, waardoor een helder contrast (of negatief contrast) ontstaat
(2) . B+faseplaat: Vertraag het afgebogen licht met 1/4 λ en trek de lichtgolven af na het combineren van de assen van twee sets lichtstralen, wat resulteert in een afname van de amplitude en het vormen van een donker contrast (of positief contrast). De structuur wordt donkerder dan het omringende medium
