Waarom moet ik een confocale microscoop gebruiken?
1. De optische microscoop is geperfectioneerd dankzij de inspanningen en verbeteringen van onze grote voorgangers. In feite kan de gebruikelijke microscoop ons gemakkelijk en snel prachtige microscopische beelden opleveren. De gebeurtenis die echter een revolutie teweegbracht in de wereld van bijna perfecte microscopen was de uitvinding van de "laserscanning confocale microscoop". Dit nieuwe type microscoop wordt gekenmerkt door een optisch systeem dat alleen beeldinformatie extraheert van het oppervlak waarop de focus is geconcentreerd, en door de focus te veranderen terwijl de verkregen informatie in het beeldgeheugen wordt hersteld, is het mogelijk een scherp beeld te verkrijgen met volledige 3-dimensionale informatie. Op deze manier is het mogelijk om eenvoudig informatie te verkrijgen over de vorm van het oppervlak die niet met een conventionele microscoop kan worden bevestigd. Hoewel "toenemende resolutie" en "verdiepen van de scherptediepte" tegenstrijdige omstandigheden zijn voor conventionele optische microscopen, vooral bij hoge vergroting, wordt dit probleem bovendien opgelost met confocale microscopen.
2. Voordelen van confocaal optisch systeem
Schematisch diagram van laserconfocale microscoop
Het confocale optische systeem is een puntverlichting van het monster, terwijl het gereflecteerde licht ook wordt ontvangen met behulp van een puntreceptor. Wanneer het monster in het brandpunt wordt geplaatst, bereikt bijna al het gereflecteerde licht de fotoreceptor, en wanneer het monster onscherp is, kan het gereflecteerde licht de fotoreceptor niet bereiken. Met andere woorden: in een confocaal optisch systeem wordt alleen het beeld weergegeven dat samenvalt met het brandpunt, en worden vlekken en nutteloos verstrooid licht geblokkeerd.
3. Waarom een laser gebruiken?
In een confocaal optisch systeem wordt het monster op een punt belicht en wordt het gereflecteerde licht ontvangen door een puntsensor. Daarom is een puntlichtbron noodzakelijk. Lasers zijn in hoge mate een puntlichtbron. In de meeste gevallen is de lichtbron voor confocale microscopen een laserlichtbron. Bovendien zijn de monochromaticiteit, directionaliteit en uitstekende straalvorm van lasers belangrijke redenen voor hun wijdverbreide acceptatie.
4. Real-time observatie op basis van high-speed scanning is mogelijk.
Voor laserscannen wordt in horizontale richting een akoestische optische afbuigeenheid (Acoustic Optical Deflector, AO prime) gebruikt en in verticale richting een servo-elektronisch gestuurde straalscanspiegel (Servo Galvano-mirror). Omdat er geen mechanische trillingen in de AO Deflector optreden, is scannen op hoge snelheid mogelijk en is real-time observatie op het monitorscherm mogelijk. De hoge snelheid van deze camera is een zeer belangrijk item dat rechtstreeks van invloed is op de snelheid van scherpstellen en het ophalen van positie.
5. Relatie tussen focuspositie en helderheid
In een confocaal optisch systeem wordt het monster correct in de brandpuntspositie geplaatst wanneer de helderheid zui groot is; ervoor en erachter zal de helderheid scherp worden verminderd (doorgetrokken lijn in Figuur 4). Deze gevoelige selectiviteit van het brandpuntsvlak is het principe achter de hoogteoriëntatie van de confocale microscoop en de uitbreiding van de focusdiepte. Daarentegen vertonen de gebruikelijke optische microscopen geen significante verandering in helderheid voor en na de brandpuntspositie (stippellijn in figuur 4).
6. Hoog contrast, hoge resolutie
In een conventionele optische microscoop interfereert het gereflecteerde licht van het onscherpe gedeelte van de microscoop met het focale beeldgedeelte van de microscoop en overlapt het, wat resulteert in een afname van het beeldcontrast. In een confocaal optisch systeem daarentegen wordt verstrooid licht buiten het brandpunt en binnen de objectieflens vrijwel volledig verwijderd, wat resulteert in beelden met een zeer hoog contrast. Bovendien wordt het oplossend vermogen van de microscoop verbeterd doordat het licht tweemaal door de objectieflens gaat, waardoor het puntbeeld scherper wordt.
7. Optische lokalisatiefunctie
In het confocale optische systeem wordt het gereflecteerde licht afgeschermd door de micro-opening op een ander punt dan het brandpunt. Als gevolg hiervan wordt bij het observeren van een driedimensionaal monster het beeld gevormd alsof het monster met het brandpunt in plakjes is gesneden (Fig. 5). Dit effect wordt optische lokalisatie genoemd en is een van de kenmerken van confocale optische systemen.
